周國海 張 泳 趙力超 陳 奇 曹 庸

（1.泰州學(xué)院醫(yī)藥與化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

蛹蟲草（cordycepsmilitaris），又名北冬蟲夏草，與冬蟲夏草同屬不同種，同樣具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎癥、降血糖等眾多功能［1，2］。天然的冬蟲夏草對生長環(huán)境要求苛刻，自然寄生率低，人工培養(yǎng)困難，因此價格昂貴。相比而言，蛹蟲草不僅分布廣泛，且人工培養(yǎng)技術(shù)成熟、成本低廉，已實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，逐漸成為冬蟲夏草的理想替代品，具有很高的開發(fā)利用價值［3］。其中，蛹蟲草多糖是蛹蟲草中含量最高的藥理活性物質(zhì)，將其提取出來作為原料開發(fā)成相應(yīng)保健產(chǎn)品，比起直接進食蛹蟲草，前者不僅具有更高的消化吸收效率，而且能避免后者因達到功效所需而進食大量蛹蟲草的不足。因此如何提高蛹蟲草多糖的提取率、獲得更多更純的活性蛹蟲草多糖是對其進行開發(fā)利用的重要研究基礎(chǔ)。

目前多糖的提取方法主要有常規(guī)水提法、超聲波輔助提取法、酶解法和超臨界流體法等［4］。超聲波輔助提取法是利用空化產(chǎn)生的極大壓力使物料細胞壁破裂而促進胞內(nèi)物質(zhì)的溶出，雖有一定的助提作用，但在此過程中多糖的結(jié)構(gòu)容易遭到破壞，而且在實際生產(chǎn)中設(shè)備的穩(wěn)定性及安全性也難以保證［5］。酶解法是通過加入纖維素酶、果膠酶等裂解細胞壁使多糖更好地溶出，但酶試劑通常價格較貴限制了其工業(yè)應(yīng)用。超臨界流體法是指以超臨界流體作為萃取劑，通過調(diào)節(jié)溫度和壓力改變流體的極性，從而改變目標產(chǎn)物的溶解度，實現(xiàn)選擇萃取與分離。該法缺點是所需設(shè)備和操作都在高壓下進行，要求及負荷較大，生產(chǎn)成本高，而且整個提取過程需要精密控制。顯然，以上幾種常用提取方法均存在較多不足，而且大部分都只停留在實驗室研究階段，尚未實現(xiàn)真正意義上的工業(yè)化生產(chǎn)。相比之下，常規(guī)水法提取使用的溶劑是水，廉價易得。多糖是由單糖通過糖苷鍵連接而成的高分子多聚物，含有很多羥基，極性較大，易溶于水，因此該方法有較好的提取率。而且常規(guī)水提法對設(shè)備要求低，操作簡單，生產(chǎn)成本小，適合于多糖提取的工業(yè)化應(yīng)用［6］。

水法提取的多糖中通常含有單糖、蛋白等雜質(zhì)，在利用之前需要對其進行分離純化，在醇沉過程中通過調(diào)節(jié)多糖濃縮液濃度和乙醇濃度可去除單糖。剩下的主要雜質(zhì)則是蛋白，常用的脫除方法包括Sevage法、酶法、等電點法和鹽析法［7］。Sevage法需要加入氯仿等有機溶劑，有一定毒性，容易造成多糖活性下降。而且該法需要重復(fù)操作多次，每次除去蛋白質(zhì)的變性膠狀物時，部分多糖會隨著蛋白一起沉淀導(dǎo)致多糖損失嚴重。酶法需要加入蛋白酶試劑，價格昂貴，且通常需要針對不同蛋白質(zhì)而聯(lián)用幾種酶制劑，成本較高，限制了其應(yīng)用。等電點鹽析法是指利用鹽改變蛋白質(zhì)在溶液中的離子強度，使其表面的大量電荷被中和，在等電點下分子凈電荷為零，分子之間容易發(fā)生碰撞、聚集而沉淀下來。該法具有操作簡單、成本低、對生物活性多糖具有穩(wěn)定作用等優(yōu)點，更適用于多糖的去蛋白純化［8］。

本試驗通過對蛹蟲草的重要活性物質(zhì)蛹蟲草多糖進行水法提取和醇沉、去蛋白等純化工藝研究，優(yōu)化蛹蟲草多糖的最佳制備工藝，希望能對更好地開發(fā)利用蛹蟲草提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草子實體粉末：無極限（中國）有限公司；

牛血清蛋白：美國Sigma公司；

無水葡萄糖、硫酸鋅、無水乙醇等：分析純，廣州湘喜生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

中藥粉碎機：119型，浙江瑞安永歷制藥機械；

紫外可見分光光度計：UV-2350型，上海尤尼柯儀器有限公司；

鼓風(fēng)干燥箱：DHG9070型，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴箱：600型，維城試驗器材有限公司；

電子天平：JA2003型，上海精密科學(xué)儀器廠；

高速臺式離心機：TGL-16G型，上海安亭儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛹蟲草多糖制備工藝流程

蛹蟲草子實體粉末→水浴浸提→過濾→清液→濃縮→醇沉→離心→沉淀→烘干→去離子水復(fù)溶→去蛋白→離心→沉淀→烘干→蛹蟲草多糖

1.3.2 樣品糖含量和蛋白質(zhì)含量測定

（1）總糖測定：硫酸苯酚法［9］；

（2）還原糖測定：3，5-二硝基水楊酸比色法［10］；

（3）蛋白質(zhì)測定：考馬斯亮藍比色法［11］；

（4）多糖含量測定：樣品中總糖含量減去樣品中還原糖的含量，即：多糖含量＝總糖含量－還原糖含量。（5）多糖提取率的測定：按式（1）計算。

1.3.3 蛹蟲草多糖提取單因素試驗

（1）提取溫度單因素試驗：稱取6份質(zhì)量為5g的蛹蟲草子實體粉末，每份按照液料比30∶1（V∶m）加入蒸餾水，分別置于溫度為40，50，60，70，80，90℃的水浴中進行多糖的提取，2h后以250mL離心杯在4 000r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，將上清液定容至200mL容量瓶中，取適量樣液進行總糖及還原性糖的含量測定，計算多糖提取率，考察提取溫度對多糖提取率的影響［12］。

（2）提取時間單因素試驗：稱取5份質(zhì)量為5g的蛹蟲草子實體粉末，每份按照液料比30∶1（V∶m）加入蒸餾水，置于提取溫度為70℃的水浴中分別進行1，2，3，4，5h的多糖提取，然后以250mL離心杯在4 000r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，將上清液定容至200mL容量瓶中，取適量樣液進行總糖及還原性糖的含量測定，計算多糖提取率，考察提取時間對多糖提取率的影響。

（3）液料比單因素試驗：稱取6份質(zhì)量為5g的蛹蟲草子實體粉末，分別按照液料比10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，5 0∶1，60∶1（V∶m）加入蒸餾水，置于提取溫度為70℃的水浴中分別進行多糖的提取，2h后以250mL離心杯在4 000r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，將上清液定容至200mL容量瓶中，取適量樣液進行總糖及還原性糖的含量測定，計算多糖提取率，考察液料比對多糖提取率的影響。

1.3.4 蛹蟲草多糖提取正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取3個因素，每個因素選取3個水平，進行L9（34）正交試驗優(yōu)化蛹蟲草多糖的提取條件。

1.3.5 多糖提取液的醇沉工藝

（1）濃縮液濃度的影響：按照正交試驗優(yōu)化的最佳條件進行蛹蟲草多糖的水浴提取，將提取液分別濃縮至8%，10%，12%，14%，17%的濃度，分別加入3倍體積的無水乙醇。置于4℃冰箱中醇沉8h，然后在4 000r/min下離心2 0min，收集沉淀物，干燥即得粗多糖，稱重計算提取率，考察濃縮液濃度對多糖提取率的影響。

（2）乙醇濃度的影響：按照正交試驗優(yōu)化的最佳條件進行蛹蟲草多糖的水浴提取，將提取液濃縮至14%的濃度分別加入無水乙醇，使乙醇的最終濃度達到50%，60%，70%，80%，90%。置于4℃冰箱中醇沉8h，然后在4 000r/min下離心20min，收集沉淀物，干燥即得粗多糖，稱重計算提取率，考察乙醇濃度對多糖提取率的影響［13］。

1.3.6 多糖的去蛋白工藝

（1）pH的影響：用蒸餾水將在上述最優(yōu)條件下獲得的蛹蟲草多糖溶解并定容至500mL，吸取體積為30mL的多糖溶液5份，分別調(diào)節(jié)pH值為1，2，3，4，5。置于4℃冰箱中沉淀8h，然后在4 000r/min下離心20min，取上清液測定蛋白質(zhì)和多糖含量，考察pH對蛋白脫除率和多糖保留率的影響［14］。

（2）硫酸鋅的影響：用蒸餾水將上述最優(yōu)條件下獲得的蛹蟲草多糖溶解并定容至500mL，吸取體積為30mL的多糖溶液5份，調(diào)節(jié)pH值至3，加入硫酸鋅使其質(zhì)量分數(shù)分別為2%，4%，6%，8%，10%。放置在4℃冰箱中沉淀8h，然后在4 000r/min下離心20min，取上清液測定蛋白質(zhì)和多糖含量，考察不同質(zhì)量分數(shù)的硫酸鋅對蛋白脫除率和多糖保留率的影響。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 以上所有試驗數(shù)據(jù)平行測定3次，結(jié)果用平均值±標準偏差表示，采用Statistica 6.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線及回歸方程

2.1.1 總糖 根據(jù)硫酸苯酚法測定總糖含量并繪制總糖標準曲線，求得回歸方程為Y（吸光度）＝10.35X（總糖濃度，m g/mL）－0.006，r2＝0.998，說明總糖濃度在規(guī)定范圍內(nèi)線性良好。

2.1.2 還原糖 根據(jù)3，5-二硝基水楊酸測定還原糖含量并繪制還原糖標準曲線，求得回歸方程為Y（吸光度）＝0.573 6X（還原糖濃度，mg/mL）－0.010 3，r2＝0.998 3，說明還原糖濃度在規(guī)定范圍內(nèi)線性良好。

2.1.3 蛋白質(zhì) 根據(jù)考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量并繪制蛋白質(zhì)標準曲線，求得回歸方程為Y（吸光度）＝4.792 9X（蛋白質(zhì)濃度，mg/mL）－0.000 5，r2＝0.999 1，說明蛋白質(zhì)濃度在規(guī)定范圍內(nèi)線性良好。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 提取溫度的影響 由圖1可知，在選取的水平范圍內(nèi)隨著提取溫度的上升，蛹蟲草多糖的提取率基本呈現(xiàn)增加的趨勢。提取溫度的升高可以加劇多糖分子的運動，促使多糖從細胞進入溶液中［15］。提取溫度在70℃之前，隨著溫度的升高，提取率增加明顯；在70℃之后，多糖的提取率趨于平穩(wěn)。因此，選擇60，70，80℃進行正交試驗。

2.2.2 提取時間的影響 由圖2可知，在選取的水平范圍內(nèi)隨著提取時間的增加，蛹蟲草多糖的提取率呈現(xiàn)了先增后減的現(xiàn)象。多糖的溶解平衡需要一定的時間，在達到平衡前隨著時間的增加，多糖溶出更多因此提取率也越大；但到達平衡后多糖的溶出量基本趨于穩(wěn)定，提取率增加幅度變小，再延長提取時間甚至還會導(dǎo)致多糖出現(xiàn)不穩(wěn)定而降解，導(dǎo)致提取率下降［16］。從圖2還可以看出，提取時間在3h之前，隨著時間的增加多糖提取率增加明顯，在3～4h時，提取率增加幅度已經(jīng)很小，并且達到最大值；在4h之后提取率出現(xiàn)了下降。因此選取提取時間2，3，4h這3個水平進行正交試驗。

2.2.3 液料比的影響 由圖3可知，在選取的水平范圍內(nèi)隨著料液比的增加，蛹蟲草多糖的提取率基本保持了增加的趨勢。在一定質(zhì)量的原料中加入更多的提取溶劑，能促進原料與溶劑的接觸，增加多糖的溶出使提取率升高［17］。當液料比從10∶1（V∶m）增加到30∶1（V∶m）時，多糖的提取率上升明顯；在30∶1（V∶m）之后再增加液料比提取率已經(jīng)變化很小。因此，選擇20∶1，30∶1，40∶1（V∶m）的液料比水平進行正交試驗。

圖1 提取溫度對蛹蟲草多糖提取率的影響Figure 1 Effect of temperature on polysaccharide extraction yield

圖2 提取時間對蛹蟲草多糖提取率的影響Figure 2 Effect of time on polysaccharide extraction yield

圖3 液料比對蛹蟲草多糖提取率的影響Figure 3 Effect of liquid to material on polysaccharide extraction yield

2.3 正交試驗

在單因素基礎(chǔ)上確定的正交試驗因素及水平設(shè)計見表1，試驗結(jié)果及數(shù)據(jù)方差分析見表2、3。

表1 正交試驗因素及水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

＊差異顯著。

離差來源 偏差平方和 自由度 方差 F值 P值提取溫度 0.515 2 0.257 58.068 0.017＊ 液料比 0.252 2 0.126 28.474 0.034＊提取時間 0.184 2 0.092 20.774 0.046＊隨機誤差0.009 2 0.004總和0.960 8

由表2、3可知，影響蛹蟲草多糖提取率的主次因素排序為提取溫度＞液料比＞提取時間，且3個因素對多糖提取率的影響都達到顯著水平。最優(yōu)組合為A3B2C3，即提取溫度80℃、液料比30∶1（V∶m）和提取時間4h。

按照正交優(yōu)化的最佳工藝進行驗證性實驗，多糖提取率均值為9.16%，比正交試驗組中A2B2C3條件下8.97%的提取率還高0.19%，因此選擇A3B2C3，即提取溫度80℃、液料比30∶1（V∶m）和提取時間4h為最優(yōu)的蛹蟲草多糖提取條件，整個試驗誤差小，方法穩(wěn)定。

2.4 醇沉工藝結(jié)果

2.4.1 濃縮液濃度的影響 由圖4可知，隨著濃縮液濃度的增加，醇沉后多糖的提取率呈現(xiàn)上升趨勢。當濃度由8%增加到14%時提取率上升顯著，而濃度達到14%后增加幅度已經(jīng)變得平緩。綜合考慮濃縮的成本及繼續(xù)濃縮可能會析出晶體，選擇14%的濃縮液濃度為最佳條件。

2.4.2 乙醇濃度的影響 由圖5可知，隨著乙醇濃度的增加，醇沉后多糖的提取率呈現(xiàn)上升趨勢。乙醇濃度由50%增加到80%過程中，提取率增加明顯；當達到80%以后，再增加乙醇的濃度，提取率也變化不大接近平衡。因此選擇乙醇濃度為80%作為最佳的醇沉條件。

圖4 濃縮液濃度對多糖提取率的影響Figure 4 Effect of extract concentration on polysaccharide extraction yield

圖5 乙醇濃度對多糖提取率的影響Figure 5 Effect of ethanol concentration on polysaccharide extraction yield

2.5 脫蛋白工藝結(jié)果

2.5.1 pH的影響 由圖6可知，隨著pH值的降低，蛋白質(zhì)的脫出率呈現(xiàn)增加趨勢。但是這個過程中，多糖的保存率也表現(xiàn)出慢慢下降的趨勢，即多糖的損失也會加大。在較低的pH酸性條件下，多糖分子容易發(fā)生水解損失。綜合考慮在pH＝3時，蛋白脫除率較好而多糖基本沒有損失［18］。

圖6 pH對蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響Figure 6 Effect of pH on protein removal rate and opolysaccharide extraction yield

2.5.2 硫酸鋅的影響 由圖7可知，隨著硫酸鋅質(zhì)量分數(shù)的升高，蛋白質(zhì)脫除率在剛開始時上升明顯，但達到4%后蛋白質(zhì)脫除率基本趨于穩(wěn)定。對于多糖保存率，當硫酸鋅質(zhì)量分數(shù)超過4%之后出現(xiàn)了明顯的下降。綜合考慮選擇4%的硫酸鋅作為最佳鹽析條件［12］。

圖7 硫酸鋅對蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響Figure 7 Effect of Mass fraction of Zinc Sulfate on protein removal rate and opolysaccharide extraction yield

3 結(jié)論

本試驗以蛹蟲草子實體為原料，對蛹蟲草多糖進行提取純化的工藝研究，尋找蛹蟲草多糖的最佳制備條件。結(jié)果表明：最佳工藝為先在液料比30∶1（V∶m）、提取溫度70℃和提取時間4h下提取多糖，然后在濃縮液濃度為14%、乙醇溶液濃度為80%下進行醇沉，再調(diào)節(jié)多糖溶液的pH＝3并加入4%的硫酸鋅。整個工藝多糖提取率為8.97%，純度高達68.9%，有良好的去雜純化效果且多糖損失較小。該研究為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)蛹蟲草多糖提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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