范文教 孫俊秀 陳云川 易宇文 刁 潘

（1.四川旅游學(xué)院食品科學(xué)系，四川 成都 610100；2.四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都 610065）

豆腐含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素B1、B2和微量元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［1］。因其營(yíng)養(yǎng)豐富、水分含量高，給微生物的生長(zhǎng)繁殖創(chuàng)造良好條件，引起吲哚、硫化氫、有機(jī)酸等一系列腐敗代謝產(chǎn)物的積累，從而造成豆腐腐敗變質(zhì)，可以說(shuō)豆腐腐敗主要是微生物活動(dòng)的結(jié)果［2］。在大多數(shù)情況下，豆腐中所含微生物中只有部分微生物參與這個(gè)腐敗變質(zhì)過(guò)程，這些在豆腐腐敗變質(zhì)中快速生長(zhǎng)繁殖并產(chǎn)生腐敗代謝產(chǎn)物的微生物，就是豆腐的特定腐敗菌［3］。由于豆腐的特定腐敗菌與豆腐品質(zhì)和貨架期之間存在密切關(guān)系，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中往往可以通過(guò)控制特定腐敗菌生長(zhǎng)繁殖來(lái)改善產(chǎn)品品質(zhì)，延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期。因此，研究不同環(huán)境因子對(duì)這些特定腐敗菌的消長(zhǎng)特性并揭示其間的內(nèi)在聯(lián)系，是建立豆腐制品品質(zhì)安全控制措施的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。

食品的防腐技術(shù)主要核心是基于阻止殘留的腐敗菌和致病菌的生長(zhǎng)繁殖。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中將不同防腐技術(shù)的原理歸結(jié)于少數(shù)幾個(gè)因子，然后針對(duì)這些因子的防腐特性，綜合研究抑制引起食品腐敗的微生物的措施，并形成對(duì)特定腐敗微生物的多樣化協(xié)同，達(dá)到強(qiáng)化防腐保鮮的作用［4］。盡管目前對(duì)豆腐中特定腐敗菌堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的形態(tài)特性以及生化信息表達(dá)有所研究，但對(duì)其消長(zhǎng)特性規(guī)律特別是在特定環(huán)境下的因子對(duì)消長(zhǎng)特性規(guī)律的影響還鮮有報(bào)道。例如李博等［3］以天然豆?jié){為培養(yǎng)基，研究GDL豆腐中堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，初步確定其生長(zhǎng)曲線(xiàn)的初級(jí)模型，但研究并未涉及環(huán)境因子對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌消長(zhǎng)特性的影響。本研究擬以豆腐中分離純化得到的特定腐敗菌（堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌）為研究對(duì)象，考察加熱強(qiáng)度、pH、鈣離子濃度以及水分活度等環(huán)境因子對(duì)其消長(zhǎng)特性的影響，旨在為研究豆腐制品生產(chǎn)和貯運(yùn)過(guò)程中特定腐敗菌的控制技術(shù)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種：由南豆腐（購(gòu)于成都市光榮豆制品廠）中分離得到的特定腐敗菌堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌；

營(yíng)養(yǎng)肉湯：生化試劑，市售；

豆?jié){培養(yǎng)基：豆?jié){樣品于121℃滅菌20min，低溫儲(chǔ)藏備用；

豆腐培養(yǎng)基：豆腐樣品碾碎后于121℃滅菌20min，低溫儲(chǔ)藏備用。

1.2 試驗(yàn)儀器

無(wú)菌操作臺(tái)：SW-CJ-1BU型，蘇州博蘭特實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)工程有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：KXB-11A型，上海儀器廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：ZC-18型，中山市遠(yuǎn)禾電器公司；

數(shù)字式移液槍?zhuān)篋P64528型，美國(guó)Dragon公司。

1.3 菌種活化

將堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌接種于無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯上，于37℃培養(yǎng)24h后，60℃水浴30min將菌種活化，然后根據(jù)試驗(yàn)需求做成適宜的稀釋度。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 熱處理強(qiáng)度對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的影響 取1mL活化菌懸液接種于裝有9mL豆?jié){培養(yǎng)基的試管中，振蕩均勻后于水浴中進(jìn)行不同強(qiáng)度熱處理，每隔5～30min取樣，迅速冷卻后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。試驗(yàn)中以豆?jié){培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.4.2 鈣離子濃度對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的影響 取1mL活化菌懸液接種于裝有9mL不同鈣離子濃度豆?jié){培養(yǎng)基的試管中，振蕩均勻后于92℃水浴中處理20min，迅速冷卻后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。試驗(yàn)中以空白豆?jié){培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.4.3 pH值對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的影響 取1mL活化菌懸液接種于裝有9mL不同pH豆?jié){培養(yǎng)基的試管中，振蕩均勻后于92℃水浴中處理20min，迅速冷卻后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。試驗(yàn)中以空白豆?jié){培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.4.4 水分活度對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的影響 取1mL活化菌懸液接種于裝有10g豆腐培養(yǎng)基的試管中，滴入不同量的豆?jié){培養(yǎng)基，振蕩均勻后于92℃水浴中處理20min，迅速冷卻后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。試驗(yàn)中以豆腐培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用originlab 8.6統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和Duncan多重檢驗(yàn)法來(lái)檢驗(yàn)平均值間的差異顯著性，并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理強(qiáng)度對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌消長(zhǎng)特性的影響

溫度是影響微生物生長(zhǎng)的最重要的因素之一。在豆腐生產(chǎn)過(guò)程中，高強(qiáng)度的熱處理工序主要有煮漿和保溫成型［5］。由圖1可知，同一熱處理強(qiáng)度下，堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的殘存菌數(shù)隨著處理時(shí)間的增加而呈遞減趨勢(shì)；同一處理時(shí)間下，堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的殘存菌數(shù)隨著熱處理強(qiáng)度的增加也呈遞減趨勢(shì)。從殘存菌數(shù)的遞減幅度上分析，當(dāng)熱處理強(qiáng)度為9 0℃時(shí)，殘存菌數(shù)下降的幅度最緩慢，在100min內(nèi)菌體總數(shù)降低仍未達(dá)到一個(gè)數(shù)量級(jí)；而熱處理強(qiáng)度為92，94，96，9 8℃時(shí)，殘存菌體總數(shù)下降約一個(gè)數(shù)量級(jí)的時(shí)間分別為70，45，20，10min。結(jié)果表明，一定熱處理強(qiáng)度對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的消長(zhǎng)特性有顯著影響，特別是在熱處理強(qiáng)度在96℃以上，即使熱處理時(shí)間不長(zhǎng)，堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌殘存菌數(shù)也很低。

圖1 不同熱處理強(qiáng)度對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌消長(zhǎng)特性的影響Figure 1 Effects of different heat treatment intensity on growth characteristics of Bacillus firmus

2.2 鈣離子濃度對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌消長(zhǎng)特性的影響

圖2 鈣離子濃度對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌消長(zhǎng)特性的影響Figure 2 Effects of different concentration of Ca2＋on growth characteristics of Bacillus firmus

豆腐生產(chǎn)過(guò)程中的點(diǎn)漿就是加入凝固劑成型的過(guò)程，常用的凝固劑有石膏、鹽鹵以及葡萄糖酸－δ－內(nèi)酯等，相應(yīng)生產(chǎn)的豆腐為嫩豆腐（南豆腐）、老豆腐（北豆腐）、內(nèi)酯豆腐［6］。本試驗(yàn)根據(jù)所加入的凝固劑石膏，來(lái)分析不同鈣離子濃度對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌消長(zhǎng)特性的影響。由圖2可知：鈣離子濃度在0～2.0%（m/V）范圍時(shí)，堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌殘存菌數(shù)變化不明顯，在熱處理過(guò)程中鈣離子濃度對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的消長(zhǎng)特性不顯著。Jiang-Gong等［7］在研究不同凝固劑對(duì)豆腐品質(zhì)的影響中認(rèn)為：鈣或鈉離子對(duì)豆腐特定腐敗菌的消亡影響不大。在煮漿過(guò)程中，鈣或鈉鹽類(lèi)的存在會(huì)增加豆?jié){的飽和度，降低豆腐成型后的水分活度，從而增加堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的耐熱性；此外，豆?jié){中鈣或鈉離子強(qiáng)度的增加會(huì)提高整個(gè)環(huán)境的水分活度，促使堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌熱敏性的增加。這與Laroche等［8］研究認(rèn)為鹽類(lèi)對(duì)微生物耐熱性的影響具有多樣性相符。不同梯度鈣離子濃度的堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌殘存菌數(shù)不同，其原因主要是因?yàn)榱蛩徕}在充當(dāng)凝固劑時(shí)，點(diǎn)漿成型后豆腐水分活性或點(diǎn)漿過(guò)程所需時(shí)間的差異造成的；此外，部分差異也可能由平板計(jì)數(shù)的誤差帶來(lái)的。

2.3 pH值對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌消長(zhǎng)特性的影響

一般來(lái)說(shuō)，微生物的生長(zhǎng)pH值范圍極廣，但是絕大多數(shù)種類(lèi)都生活在pH 5.0～9.0［9］。由圖3可知，以pH 6.6為臨界點(diǎn)，隨著pH值的增加或降低，堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌體的殘存菌數(shù)明顯減少。說(shuō)明在熱處理過(guò)程中pH對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌消長(zhǎng)規(guī)律影響顯著。有研究［10］表明酸堿度對(duì)微生物消亡特性的影響，主要表現(xiàn)在影響微生物細(xì)胞自身細(xì)胞膜表面電荷的性質(zhì)及膜的通透性，或者改變整個(gè)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收平衡，或者徹底改變細(xì)胞本身的酶促反應(yīng)速率及代謝途徑。

圖3 pH值對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌消長(zhǎng)特性的影響Figure 3 Effects of different pH on growth characteristics of Bacillus firmus

2.4 水分活度對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌消長(zhǎng)特性的影響

微生物生長(zhǎng)都需要一定的水分。研究［11］表明：特定微生物的生長(zhǎng)局限于所在介質(zhì)的水分活度。一般來(lái)說(shuō)，只有當(dāng)環(huán)境中的水分活度大于某一臨界值時(shí)，微生物才能正常的生長(zhǎng)繁殖。

由圖4可知：隨著水分含量的增加，堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌體的殘存菌數(shù)也呈增加趨勢(shì)，但增量不明顯，表明在熱處理過(guò)程中不同水分活度對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌消長(zhǎng)特性有一定影響。

3 結(jié)論

圖4 水分活度對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌消長(zhǎng)特性的影響Figure 4 Effects of different moisture content on growth characteristics of Bacillus firmus

環(huán)境因子對(duì)豆腐特定腐敗菌堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的消長(zhǎng)特性具有不同程度的影響。本研究通過(guò)試驗(yàn)分析了加熱強(qiáng)度、pH、鈣離子濃度、水分活度這4個(gè)環(huán)境因子對(duì)豆腐特定腐敗菌堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌消長(zhǎng)特性的影響。結(jié)果表明，熱處理強(qiáng)度和pH對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌消長(zhǎng)規(guī)律影響顯著，水分活度對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌消長(zhǎng)規(guī)律有一定的影響，鈣離子濃度的影響不顯著。因此，在保證豆腐品質(zhì)的條件下，這些環(huán)境因子對(duì)豆腐特定腐敗菌消長(zhǎng)特性，可為豆腐制品生產(chǎn)和貯運(yùn)過(guò)程中特定腐敗菌的控制技術(shù)提供參考數(shù)據(jù)。

1 李曉東.功能性大豆食品［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

2 李除夕，董明盛，陳曉紅，等.豆腐中庫(kù)特氏菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型和貨架期預(yù)測(cè)［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2009，25（Supp.1）：82.

3 李博.GDL豆腐中主要腐敗菌的研究及HACCP的建立［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

4 張佳敏，王衛(wèi)，唐仁勇.泡椒鳳爪防腐保藏及柵欄因子調(diào)控研究［J］.食品工業(yè)科技，2014，32（2）：291～295.

5 盧義伯，潘超，祝義亮.豆腐生產(chǎn)中不同制漿工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2007，28（8）：182～184.

6 中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 22106—2008 非發(fā)酵豆制品［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

7 Jiang-Gong Liu，Tser-Sheng Lin，Wun-Yuan Lin.Evaluating the growth of Listeria monocytogenes that has been inoculated into tofu containing background microflora［J］.Food Control，2010，21（12）：1 764～1 768.

8 C Laroche，F(xiàn) Fine，P Gervais.Water activity affects heat resistance of microorganisms in food powders［J］.International Journal of Food Microbiology，2005，97（3）：307～315.

9 李宗軍.壓力 溫度處理對(duì)肉制品中微生物的影響［J］.食品與機(jī)械，2006，22（3）：14～16.

10 M C Rojo，F(xiàn) N Arroyo López，M C Lerena，et al.Effects of pH and sugar concentration in Zygosaccharomyces rouxii growth and time for spoilage in concentrated grape juice at isothermal and non-isothermal conditions［J］.Food Microbiology，2014，38（3）：143～150.

11 曾鋒，張立彥，曾慶孝.微生物對(duì)食品防腐劑的抗藥性研究進(jìn)展［J］.食品與機(jī)械，2005，21（2）：51～53.