孫術國 楊 濤 林親錄 蔣春燕 唐澤君 蘭 青 羅非君

(1.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南長沙 410004;2.稻谷及副產物深加工國家工程實驗室，湖南長沙 410004)

水稻是世界上主要的糧食作物，目前為世界2/3的人口提供口糧［1］。大米蛋白是大米的重要組分，其中賴氨酸含量較高，與其它糧食作物相比，大米具有更好的氨基酸組成和配比，更利于人體消化，因而營養(yǎng)價值高［2］，因此，大米是人類重要的蛋白來源。然而，稻米經不同處理工序獲得的大米，其蒸煮品質、食用品質和營養(yǎng)品質也有所差異，譬如稻米經發(fā)芽處理，其整體營養(yǎng)品質提高，但食用品質(主要口感和風味)變差，而稻米經礱谷、拋光處理獲得精米，其食用品質提高，但營養(yǎng)品質降低。而且，目前很多研究［3－7］表明食品來源的多肽具有較好的抗氧化活性，能幫助人體清除自由基，減少疾病的產生。也有專家［8］研究了大米多肽的抗氧化活性，然而，其研究對象僅局限單一加工處理的稻米，缺乏不同加工處理對大米營養(yǎng)品質影響的研究。為了更好地了解稻米經不同加工處理獲得大米營養(yǎng)品質和生物活性，本試驗將大米多肽作為研究對象，研究不同稻米經不同加工處理獲得大米多肽含量，特別是不同大米原料的多肽抗氧化性的差異，從而更加準確地掌握不同稻米經不同加工處理獲得大米的營養(yǎng)品質和活性功能，為人類合理膳食提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

同品種的發(fā)芽糙米、糙米和精米:長沙尚海農業(yè)科技有限公司;

鐵氰酸鉀、三氯化鐵、三氯乙酸(TCA)、雙縮脲試劑、過氧化氫溶液、水楊酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、過硫酸鉀等:分析純，國藥集團化學試劑有限公司;

還原型谷胱甘肽標準品:純度＞98%，美國Sigma公司。

1.2 主要儀器與設備

高速萬能粉碎機:QE-200g型，廣州市大祥電子機械設備有限公司;

水浴鍋:DZKW-4型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司;

臺式高速離心機:L530型，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;

電子天平:GR-202型，上海匯分電子科技有限公司;可見分光光度計:722s型，上海棱光技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大米多肽的提取 準確稱取20.0 g大米，將其浸泡在100 mL蒸餾水中15 h，然后打漿進行酶水解反應。酶反應條件:加入1萬U堿性蛋白酶、酶促反應在0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS溶液，pH 9.0;采用pH—slat法使體系pH穩(wěn)定)中，溫度控制50℃，反應時間30 min。酶水解反應結束后，95℃條件下滅酶10 min，冷卻后以5 000 r/min離心15 min，上清液再經真空濃縮、冷凍干燥(濃縮多肽溶液經 －30℃預冷凍，然后置于真空度0.12 MPa真空冷凍干燥機內，每5 h升溫5℃，升溫5次，然后每2 h升溫5℃，干燥30 h)，最終獲大米多肽凍干粉待用。

1.3.2 多肽標準曲線繪制 分別取7個10 mL的容量瓶，用 5%的 TCA 依次配制成 0，0.24，0.32，0.40，0.48，0.56，0.64 mg/mL還原谷胱甘肽標準溶液，然后分別取6.0 mL，加入4.0 mL雙縮脲試劑，混合反應10 min，再經2 000 r/min離心15 min，結束后取其上清液，在540 nm下測定OD值。以多肽的濃度為橫坐標X(mg/mL)，OD值為縱坐標，制作標準曲線，見圖1。

圖1 多肽測定標準曲線Figure 1 Standard curve for measuring polypeptides

1.3.3 多肽抗氧化研究

(1)總還原能力:考察大米多肽對三價鐵離子的還原能力。參照文獻［9］，將不同體積的大米多肽樣液加入2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液中(0.2 mol/L，pH 6.6)，各管加入2.5 mL鐵氰化鉀(1%，m/V)，混合均勻后在50℃水浴反應30 min，最后再加入2.5 mL TCA(10%，m/V)?；旌衔锝? 000 r/min離心10 min。將2.5 mL上清液、2.5 mL蒸餾水、0.5 mL氯化鐵溶液(0.1%，m/V)混合反應10 min，然后在700 nm下測定OD值。

(2)羥基自由基(·OH)清除能力:參照文獻［10］，向試管中加入1.00 mL蒸餾水或多肽樣液，2.00 mL FeSO4溶液，1.50 mL水楊酸—乙醇溶液，最后加0.10 mL H2O2(0.03%)啟動反應，振蕩混合，水浴37℃，保溫30 min，在波長510 nm處測定其吸光度值。羥基自由基清除率按式(1)計算:

式中:

Cr(·OH)——羥基自由基清除率，%;

Ao——空白管的吸光度，0.721;

A樣——加入自由基清除劑后的吸光度，a.u。

(3)ABTS自由基清除活性:參照文獻［11］。配制7 mmol/L ABTS溶液，其中有濃度為2.45 mmol/L的過硫酸鉀，混合溶液室溫避光14 h。將生成ABTS自由基溶液用PBS溶液(0.01 mol/L，pH 7.4)稀釋，控制此時溶液在 734 nm的OD值為0.70。取不同體積大米多肽樣液置于50 mL容量瓶中，采用蒸餾水定容，再取50 μL樣液與150 μL ABTS自由基溶液混合，搖勻，室溫下放置10 min，在波長734 nm處測定其吸光度值。ABTS自由基清除率按式(2)計算:

式中:

Cr(ABTS)——ABTS自由基清除率，%;

A樣——加入自由基清除劑后的吸光度，a.u。

1.3.4 統(tǒng)計分析 每個樣品設置3個重復，試驗采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 3種原料大米酶解提取物中多肽含量

采用本試驗建立的多肽測定方法(圖1)，分析大米酶解后多肽含量，結果(表1)表明，發(fā)芽糙米多肽含量顯著高于普通糙米和精米(P＜0.05)，其中精米多肽含量最低。由于大米多肽是一種生物活性肽，試驗結果一定程度反映了發(fā)芽糙米的營養(yǎng)價值和生物活性要優(yōu)于普通糙米和精米，原因可能在于糙米在發(fā)芽過程中，一些特異性酶被激活，促使一些蛋白水解產生具有生物活性的多肽，因而營養(yǎng)價值和生物活性提高，而對于精米，因加工過程中大米表面一些蛋白的損失，造成相應的功能活性肽的減少，因而營養(yǎng)價值和生物活性較低。

表1 3種大米多肽的含量Table 1 The content of polypeptides from germinated brown rice，brown rice and milled rice

2.2 3種原料大米多肽抗氧化能力分析

2.2.1 總還原力 由圖2可知，發(fā)芽糙米中多肽的總還原力強于普通糙米和精米，精米的總還原力最低，對于單一一種原料，隨著濃度的增加，大米多肽總還原能力也在不斷提高。這些結果表明，糙米經發(fā)芽處理，可能存在一些具有還原能力的氨基酸(譬如半胱氨酸)展現(xiàn)在多肽的表面或者游離出來［12］，因而發(fā)芽糙米的多肽總還原力最強。

圖2 3種原料大米多肽的總還原力比較Figure 2 Comparison of total reducing capacity of the polypeptides from germinated brown rice，brown rice and milled rice

2.2.2 羥基自由基(·OH)清除能力 由圖3可知，發(fā)芽糙米中多肽的羥自由基清除能力顯著高于普通糙米和精米(P＜0.05)，而精米多肽的羥自由基清除能力最低，造成這種原因可能是:蛋白質由多種氨基酸組成，有些氨基酸本身就具有抗氧化特性，對羥自由基的清除能力也較強，譬如色氨酸、組氨酸和其它芳香氨基酸等等［13］。糙米在發(fā)芽過程中，由于新陳代謝作用，這些具有抗氧化特性的氨基酸，可能以前呈現(xiàn)包囊狀態(tài)，現(xiàn)在經酶的作用分解產生多肽，使得這些具有清除羥基自由基的氨基酸暴露在表面，從而使它們的抗氧化特性加強，進而提高了羥自由基清除率。而對于精米，由于本身表面蛋白流失，導致具有清除羥基自由基的多肽也損失，因而羥自由基清除能力較低。

圖3 3種原料大米多肽清除羥基自由基能力比較Figure 3 Comparison of hydroxyl radical scavenging rate of the polypeptides from germinated brown rice，brown rice and milled rice

圖4 3種原料大米多肽清除ABTS能力Figure 4 Comparison of ABTS removal rate of the polypeptides from germinated brown rice，brown rice and milled rice

2.2.3 ABTS清除能力 由圖4可知，發(fā)芽糙米中的多肽的ABTS清除能力顯著強于普通糙米和精米，其中普通精米最低，結果表明糙米在發(fā)芽過程中，自身的一些營養(yǎng)功能特性得到了一定的提高。其原因可能是糙米在發(fā)芽過程中一些酶被釋放和激活，通過酶解，使一些抗氧化多肽從結合態(tài)轉化為游離態(tài)，從而使這些多肽的活性功能得以表現(xiàn)出來，對ABTS清除率也在一定程度上得到提高，在樣液體積和其它條件一致的情況下，發(fā)芽糙米中多肽的ABTS清除率比普通糙米高出約5% ～7%，比精米高出7% ～12%左右。

3 結論

發(fā)芽糙米中的多肽含量顯著高于普通糙米和精米，其中精米的多肽含量最低。發(fā)芽糙米中多肽的總還原力、羥自由基清除能力和ABTS清除能力強于普通糙米和精米，其中精米最低，對于單一一種原料，隨著濃度的增加，大米多肽總還原能力、羥自由基清除能力和ABTS清除能力也在不斷提高。本試驗結果表明糙米經發(fā)芽處理，營養(yǎng)品質得到提高，生物活性增強，而精米經歷深加工處理，營養(yǎng)品質和生物活性反而降低。然而，不同處理的大米多肽對動物是否具有抗氧化特性以及它們活性的存在差異，還需進一步進行體外試驗和體內試驗加以驗證，這項工作目前在進行中。本試驗結果為大米加工和營養(yǎng)品質研究提供了一定的借鑒。

1 Zhou Z，Robards K，Helliwell S，et al.Ageing of stored rice:changes in chemical and physical attributes［J］.J.Cereal Sci.，2002，35(1):65～78.

2 熊尉杰，昊衛(wèi)國.大米蛋白研究進展［J］.糧食與油脂，2009(4):7～9.

3 Sun Q，Shen H X，Luo Y K.Antioxidant activity of hydrolysates and peptide fractions derived from porcine hemoglobin ［J］.J.Food Sci.Technol.，2011，48(1):53 ～60.

4 Sakanaka S，Tachibana Y，Ishihara N，et al.Antioxidant activity of egg-yolk protein hydrolysates in a linoleic acid oxidation system［J］.Food Chem.，2004，86(1):99～103.

5 You L，Zhao M，Regenstein J M，et al.In vitro antioxidant activity and in vivo anti-fatigue effect of loach(Misgurnus anguillicaudatus)peptides prepared by papain digestion［J］.Food Chem.，2011，124(1):188～194.

6 Pan D，Guo Y，Jiang X.Anti-fatigure and antioxidative activities of peptides isolated from milk proteins［J］.J.Food Biochem.，2011，35:1 130～1 144.

7 Yu B，Lu Z，Bie X，et al.Scavenging and anti-fatigue activity of fermented defatted soybean peptides ［J］.Eur Food Res Technol.，2008，226(3):415～421.

8 陳正行，姚惠源，周素梅.米蛋白和米糠蛋白開發(fā)利用［J］.糧食與油脂，2002(4):6～9.

9 ?；刍?蛋清肽制備及其生物功能性研究［D］.武漢:華中農業(yè)大學，2011.

10 陳美珍，余杰，郭慧敏.大豆分離蛋白酶解物清除羥自由基作用的研究［J］.食品科學，2002，23(1):43～46.

11 范金波，任發(fā)政，孫雁，等.絲膠蛋白抗氧化肽的酶法制備及功能評價［J］.農業(yè)工程學報，2008，24(11):279～283.

12 溫煥斌.富含多膚的發(fā)芽糙米制備工藝及其抗氧化活性研究［D］.南京:南京農業(yè)大學，2009.

13 Chen H M，Muramoto K，Yamauchi F，et al.Antioxidant activity of designed peptides based on the antioxidative peptide isolated from digests of a soybean protein［J］.J.Agr.Food Chem.，1996，44(9):2 619～2 623.