尹 文，王倩梅，馮 洋，朱金文，李明月，高 路

失血性休克(hemorrhagic shock，HS)是一種臨床常見病癥，常引發(fā)急性肺損傷(acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，后期出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)［1］。其中，ALI、ARDS和MODS的共同發(fā)病基礎(chǔ)是失控性全身炎癥反應(yīng)［2］，因此近年來防治ALI/ARDS的焦點轉(zhuǎn)向炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的領(lǐng)域，成為人們關(guān)注的熱點研究方向［3］。核因子-кB(NF-кB)是一種多向性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，參與多種炎癥介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，其激活效應(yīng)在ALI/ARDS/MODS的序貫病理損害過程中發(fā)揮著重要作用［4-7］。本實驗主要在NF-кB識別靶基因кB序列的關(guān)鍵環(huán)節(jié)上采取特異性措施干預(yù)，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄表達，觀察NF-кB圈套dsODNs載體復(fù)合物對肺泡巨噬細胞體外轉(zhuǎn)染效率的影響，實驗結(jié)果可為臨床篩選特異性藥物、阻斷全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)炎癥瀑布效應(yīng)，防治ALI/ARDS提供新的靶點。

材料與方法

1 材料

健康家兔，體重1．8～2．3kg，雌雄不限，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。本實驗中實驗動物的處置方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

戊巴比妥鈉購于Gibco公司，LPS、Lipofectamine2000購于Sigma公司，兔LDH試劑盒購于上海恒遠生物科技有限公司，NF-кB ODN購于上海生工生物工程公司。

CK-40型倒置生物顯微鏡、BX51型正置熒光顯微鏡、FV1000激光共聚焦顯微鏡購于日本Olympus公司，流式細胞儀購于XXXX1-BD FACSCaibur公司。

2 方法

2.1 失血性休克動物模型建立，提取肺泡巨噬細胞(AM)實驗家兔以3%戊巴比妥鈉(40mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉后，固定于恒溫手術(shù)臺。分離其右側(cè)股動、靜脈，插管后連接于多道生理記錄儀，檢測并記錄其平均動脈壓?？焖俜叛?，使家兔平均動脈壓在15min內(nèi)降至30～40mmHg，通過回輸血液(回輸時間＞30min)維持該水平60min。待血壓平穩(wěn)后，經(jīng)股動脈采血，行血氣分析確定失血性休克致急性肺損傷動物模型建立成功［8］。氣管切開做一插管，行支氣管肺泡灌洗后，提取灌洗液，低速離心提取AM。

2.2 AM鑒定及傳代 待巨噬細胞貼壁90%后，取出培養(yǎng)瓶，傾倒瓶內(nèi)陳舊的培養(yǎng)液，用Hanks液清洗1次以消除小牛血清對胰酶活性的抑制。加入37℃的0．25%胰酶溶液，覆蓋貼壁細胞，消化3min左右，使細胞游離后終止消化，加入2ml含1%雙抗、100ml/L小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，用吸管吹打平皿底部幾次，使貼壁細胞充分脫落。以70%乙醇和清水依次清洗細胞計數(shù)板及其蓋玻片;將細胞稀釋成均勻的懸液，用毛細滴管在蓋玻片下方滴加一滴細胞懸液，使之充盈計數(shù)室;在顯微鏡下，用10×物鏡觀察計數(shù)板四角大方格內(nèi)的細胞數(shù)，計算細胞濃度和總細胞數(shù)。用消化液調(diào)節(jié)AM濃度至5×109個/ml，行瑞士染色(美藍-伊紅染色)，經(jīng)鏡檢胞漿紅色，胞核藍色者為巨噬細胞;將濃度調(diào)節(jié)至1×106細胞/ml，制備單細胞懸液;行臺盼藍染色，正常細胞不著色，死亡細胞呈淡藍色，3min內(nèi)計數(shù)活細胞和死細胞并計算活細胞百分?jǐn)?shù)，細胞活力(%)=(總細胞數(shù)-著色細胞數(shù))÷總細胞數(shù)×100%，確保細胞活力﹥95%。行AM傳代培養(yǎng)。

2.3 AM分組轉(zhuǎn)染及LDH活性檢測 分組轉(zhuǎn)染干預(yù)(n=10;每個處理組分別選取2組細胞，各設(shè)5個復(fù)孔):(1)對照組:AM經(jīng)提純并傳代后，不加任何干預(yù)，培養(yǎng)4、6、8h時分別檢測其LDH含量;(2)LPS刺激組:AM經(jīng)提純并傳代后，給予10μg/ml LPS，余同對照組;(3)Lipofectamine2000組(Lipo2000組):AM經(jīng)提純并傳代后，先后給予10μg/ml LPS和Lipofectamine2000，余 同 對 照 組;(4)NF-κB dsODNs/Lipofectamine2000組(dsODNs組):AM經(jīng)提純并傳代后，先給予10μg/ml LPS，再給予預(yù)先配置 好 的 不 同 濃 度 的 NF-κB dsODNs/Lipofectamine2000(1∶0、1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9)，余同對照組。用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)相對熒光強度和細胞攝取率;激光共聚焦顯微鏡觀察細胞爬片中的綠色熒光分布。

其中，寡聚脫氧核苷酸(ODN)由上海生工生物工程公司合成，均經(jīng)全硫代修飾，并在5'端標(biāo)記異硫氰酸熒光素(FITC)(激發(fā)光:488nm;發(fā)射光525nm。)序列如下:

ODN退火采用等摩爾互補單鏈ODN混合，98℃水浴5min，然后緩慢降至室溫，形成雙鏈脫氧核苷酸(dsODNs)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 流式細胞儀檢測細胞內(nèi)相對熒光強度和細胞攝取率 分別取NF-κB dsODNs/Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染處理4、6h和8h時的AM細胞懸液，將濃度調(diào)整至1×106細胞/ml，以4%多聚甲醛固定，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后，每份標(biāo)本收集10 000個細胞，用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)相對熒光強度和細胞攝取率。根據(jù)活細胞數(shù)用Cell QuestTM軟件處理數(shù)據(jù)，評價轉(zhuǎn)染效率。

2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察熒光分布 取dsODNs組的AM細胞懸液，行細胞爬片。待細胞貼壁，分裂生長密度達40%左右時為爬片標(biāo)本制作成功。樣本完成后于激光共聚焦顯微鏡下觀察、照相并記錄。2.6 統(tǒng)計分析 實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，用SPSS17．0軟件進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計方法采用等距重復(fù)測量方差分析、單因素方差分析等。

結(jié) 果

1 不同培養(yǎng)時間與細胞毒性的關(guān)系

如表1所示，對照組LDH水平隨培養(yǎng)時間增長無明顯變化趨勢。而LPS組、Lipo2000組和dsODNs組的LDH水平隨時間增長明顯升高，均在8h時水平最高(圖1)，即細胞毒性最強;且在培養(yǎng)4、6h和8h時均高于對照組。另一方面，dsODNs組的LDH水平在各培養(yǎng)時間點均明顯低于Lipo2000組(P＜0．01)和LPS組(P＜0．01)。該結(jié)果提示NF-κB dsODNs/Lipofectamine2000能夠有效減輕細胞損傷，降低細胞毒性。

2 不同dsODNs/Lipofectamine2000濃度比率與細胞毒性的關(guān)系

表1提示培養(yǎng)6h時細胞毒性適中，因此以下實驗均選取6h為例研究，實驗觀察不同比率的(dsODNs:Lipofectamine2000)轉(zhuǎn)染組中LDH值變化，結(jié)果表明隨著Lipofectamine2000比率的增加，細胞LDH含量逐漸增加，但在1∶5時出現(xiàn)折點(圖1)。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)dsODNs/Lipofectamine2000濃度比率為1∶5時產(chǎn)生的LDH與其他比率各組(除1∶3組外)相比均有統(tǒng)計學(xué)差異。該結(jié)果提示NF-кB圈套dsODNs與Llipofectamine2000在一定濃度比率范圍內(nèi)影響細胞損傷程度，而1∶5為可供選擇的合適轉(zhuǎn)染濃度。

3 轉(zhuǎn)染效率的評估

不同dsODNs/Lipofectamine2000濃度比率對轉(zhuǎn)染效率的影響如表2所示。實驗結(jié)果提示在轉(zhuǎn)染6h時，dsODNs/Lipofectamine2000各濃度比率組的平均熒光強度均較無Lipo2000組(1∶0)明顯增高，其中以1∶5組(P＜0．01)最高，細胞攝取率也以1∶5組(P＜0．01)最高，均顯著高于1∶0組。該結(jié)果提示轉(zhuǎn)染效率與脂質(zhì)體的濃度之間不呈正比關(guān)系，即單純增加Lipofectamine2000并不能有效提高轉(zhuǎn)染效率。表2的結(jié)果還提示，各濃度比率組LDH含量隨Lipofectamine2000比率的增加呈現(xiàn)增加的趨勢。綜上所述，表2的結(jié)果表明，在dsODNs/Lipofectamine2000濃度比率為1∶5、轉(zhuǎn)染時間6h時，轉(zhuǎn)染效率最高，而細胞毒性適中。

4 NF-кB圈套dsODNs在細胞內(nèi)的分布

如圖2所示，在熒光顯微鏡可見光下觀察發(fā)現(xiàn)無Lipo2000組(濃度1∶0)以及dsODNs/Lipofecetamine2000 1∶1、1∶3、1∶5組細胞形態(tài)無明顯變化;1∶7、1∶9組可見肺泡巨噬細胞變圓，突觸減少;1∶9組有一定數(shù)量的細胞死亡，出現(xiàn)漂浮現(xiàn)象。Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染各組熒光物質(zhì)分布于細胞質(zhì)和細胞核中，其中以dsODNs/Lipofectamine2000為1∶5時熒光最強，1∶0即無Lipofectamine2000、直接轉(zhuǎn)染組細胞核內(nèi)少見熒光。

dsODNs/Lipofectamine2000比率為1∶5時，不同時間點(4、6h和8h)的熒光強度檢測結(jié)果提示6h時熒光強度最大(圖3)。

圖1 不同dsODNs/Lipofectamine2000濃度比率對LDH產(chǎn)生的影響

表1 培養(yǎng)時間對LDH產(chǎn)生的影響(U/L，±s)

表1 培養(yǎng)時間對LDH產(chǎn)生的影響(U/L，±s)

與Lipo2000組比較:*P＜0．01;與LPS組比較:#P＜0．01

?

表2 dsODNs/Lipofectamine2000不同濃度比率對LDH產(chǎn)生量、熒光強度和細胞攝取率的影響

圖2 不同dsODNs/Lipofecetamine2000轉(zhuǎn)染，6h時肺泡巨噬細胞內(nèi)攝取FITC標(biāo)記的NF-кB decoy dsODNs。a．dsODNs/Lipofecetamine2000 1∶0;b．dsODNs/Lipofecetamine2000 1∶1;c．dsODNs/Lipofecetamine2000 1∶3;d．dsODNs/Lipofecetamine2000 1∶5;e．dsODNs/Lipofecetamine2000 1∶7;f．dsODNs/Lipofecetamine2000 1∶9

圖3 dsODNs/Lipofecetamine2000比率為1∶5時不同轉(zhuǎn)染時間肺泡巨噬細胞內(nèi)攝取FITC標(biāo)記的NF-кB decoy dsODNs。a．4h;b．6h;c．8h

討 論

NF-кB是一種廣泛存在于多種細胞基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，在靜息狀態(tài)下，通常以無活性的形式存在于胞漿。創(chuàng)傷、休克、內(nèi)毒素等多種胞外刺激能夠啟動細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑使其活化，調(diào)控TNF-α等細胞因子、黏附分子和炎癥相關(guān)的酶及蛋白質(zhì)的表達，介導(dǎo)SIRS誘發(fā)的臟器損傷。NF-кB是多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點，是調(diào)控炎癥細胞因子基因表達的瓶頸［9］。如果在NF-кB識別靶基因的кB序列的關(guān)鍵環(huán)節(jié)上采取特異性措施來干預(yù)、抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄表達，勢必能為我們篩選特異性藥物、阻斷SIRS炎癥瀑布效應(yīng)防治SIRS/ALI找到新的突破口。

NF-кB圈套dsODNs［10］作為一種新型的基因治療手段，合成與кB序列相一致的雙鏈寡聚脫氧核苷酸(dsODNs)，通過載體轉(zhuǎn)染入細胞，可以競爭性抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-кB與順式元件кB序列的結(jié)合，占有NF-кB的DNA結(jié)合位點，導(dǎo)致細胞內(nèi)活化的NF-кB不能結(jié)合到靶基因的啟動子區(qū)域，從而干擾轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性及其后續(xù)基因的表達。這種方法在腫瘤、器官移植等疾病的基因治療中已經(jīng)應(yīng)用。但是這需要依賴一個有效的方法提高靶細胞對NF-кB圈套dsODNs的攝取，減少細胞內(nèi)核酸酶對其的降解作用。

經(jīng)過大量研究證實，脂質(zhì)體(LPS)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法［4］是轉(zhuǎn)染寡聚脫氧核苷酸理化方法中的最佳選擇之一。陽離子脂質(zhì)體是一種高效的核酸物質(zhì)轉(zhuǎn)染載體，其表面的正電荷可與核酸的磷酸根通過靜電作用將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，也能被表面帶負(fù)電荷的細胞膜吸附，再通過細胞膜的融合或細胞內(nèi)吞作用將DNA導(dǎo)入細胞，并且可以保護基因不被核酸酶降解。脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物進入細胞質(zhì)，形成內(nèi)涵體，內(nèi)涵體膜破壞并釋放DNA;最后DNA進入細胞核并在相應(yīng)位點整合，使轉(zhuǎn)染基因得以表達。影響脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的主要因素有細胞類型、細胞密度、細胞狀態(tài)、脂質(zhì)體組成、脂質(zhì)體粒徑大小、質(zhì)粒DNA純度、DNA與脂質(zhì)體的比率、制備脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物所用緩沖液、轉(zhuǎn)染的溫度和時間等，其中DNA與脂質(zhì)體的比率是決定性的影響因素。陽離子脂質(zhì)體在基因治療方面已經(jīng)取得了喜人的成果，但仍存在一定的局限性，如對器官的靶向性不明顯，基因轉(zhuǎn)運的機制不明確等。另外，也因為其脂質(zhì)的特性和表面帶有大量的正電荷，會對細胞產(chǎn)生一定的毒性。對細胞毒性增強會影響轉(zhuǎn)染效率。LDH正常情況下存在于細胞漿內(nèi)，只有當(dāng)細胞受損細胞膜破裂或者細胞死亡裂解時才通過損傷的細胞膜泄漏到細胞外。體外培養(yǎng)時進入到細胞基質(zhì)中，在體內(nèi)則進入血液。因此，通過檢測培養(yǎng)液或血清中的LDH的含量可以間接了解 Lipofectamine2000對細胞的毒性。

本實驗結(jié)果提示:(1)LPS刺激組更加接近于人體內(nèi)環(huán)境發(fā)生內(nèi)毒素血癥時AM中NF-κB信號通路啟動、激活的病理過程。AM損傷較對照組嚴(yán)重，LDH水平明顯增高(P＜0．01)，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。(2)Lipofectamine2000是帶有大量正電荷的陽離子脂質(zhì)體，具有細胞毒性，隨著Lipofectamine2000比例的升高或轉(zhuǎn)染時間的延長，培養(yǎng)上清液中的LDH含量升高，顯微鏡下培養(yǎng)8h后可觀察到細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞的活力降低，并且部分細胞死亡，出現(xiàn)漂浮現(xiàn)象，此時轉(zhuǎn)染的效率也下降。說明細胞毒性的增加會影響轉(zhuǎn)染的效率。(3)dsODNs/Lipofecetamine2000濃度比率為1∶5，轉(zhuǎn)染時間6h時轉(zhuǎn)染效率最高。

綜上所述，本實驗通過體外摸索脂質(zhì)體載體Lipofectamine2000與dsODNs的最佳比例和轉(zhuǎn)染時間，為進一步的體內(nèi)試驗提供依據(jù)，從而在細胞分子水平為臨床防治SIRS/ALI篩選精確藥物靶點和尋求高效合理的治療方案提供前瞻性的實驗依據(jù)。

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