劉 亮 欒新平（通訊作者） 夏海成 頓志平 朱正權(quán) 杜山別克 李文婷

1）新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 烏魯木齊 830011 2）新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 烏魯木齊 830063 3）山東大學(xué)第二醫(yī)院 濟南 250033

原發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤（Glioblastoma）是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，WHO 分級Ⅳ級。大多數(shù)膠質(zhì)母細胞瘤迅速直接的發(fā)生，很少有低度惡性前期病變［1］，其惡性度高，生存期短，預(yù)后極差。近年來，膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)病趨勢呈現(xiàn)年輕化，膠質(zhì)母細胞瘤死亡率更是上升了近100%［3］。新疆是多民族聚居地區(qū)，流行病學(xué)分析顯示，維吾爾族（以下簡稱維族）膠質(zhì)母細胞瘤患者中男性發(fā)病多于女性，發(fā)病年齡較漢族患者輕，但生存期高于漢族。新疆維、漢族患者高級別膠質(zhì)瘤在發(fā)病及臨床特點等方面的不同，提示其在基因水平上，可能存在一定的差異性。本研究通過運用mRNA 表達譜芯片篩選新疆維、漢族患者高級別膠質(zhì)瘤差異基因標志物，比較新疆維、漢族患者腦膠質(zhì)母細胞瘤基因表達的差異性，初步探討維、漢族膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)病機制的差異。

1 資料與方法

1．1 一般資料 隨機選取2010—2013 年期在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除經(jīng)病理證實為膠質(zhì)母細胞瘤新鮮組織標本6例，其中維族3例，漢族3例；男2例，女4例；年齡29～56歲，中位年齡45歲；組織學(xué)分級均為Ⅳ級。標本均于-80℃的冰箱保存。所選病例經(jīng)核實無重復(fù)，年齡、性別、民族、病理診斷、影像學(xué)表現(xiàn)、術(shù)后隨訪等臨床資料完整，術(shù)前均未進行放療和化療。

1．2 提取總RNA 及mRNA 表達譜芯片檢測 Trizol（Invitrogen，美 國）和The RNeasy kit（Qiagen，德 國）進 行 總RNA 提取，具體操作按試劑盒說明進行。采用1%瓊脂糖凝膠電泳及NanoDrop Spectrophotometer 2000對總RNA 質(zhì)量分別進行定性及定量檢測。將樣本RNA 體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA，經(jīng)過質(zhì)檢的cRNA 與雜交試劑混合形成雜交樣本，放到室溫孵育，經(jīng)過高溫洗滌、乙醇洗滌及3次室溫洗滌，最后干燥，進行Illumina HT-12全基因組表達譜芯片掃描，讀取數(shù)據(jù)及獲取圖像。

2 結(jié)果

2．1 總RNA 提取的定量和定性分析 RNA 濃度＞100化ng／uL，RNA 總 量＞2 ug，經(jīng)NanoDrop2000 檢 測，純 度A260／A280比值在均＞1．90。RNA 1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示18srRNA 和28srRNA 出現(xiàn)兩條帶清晰兩條帶，說明所提取組織的總RNA 完整性好，沒有降解，純度高，可用于后續(xù)mRNA 表達譜芯片檢測。

2．2 差異基因篩選及生物信息學(xué)分析 將芯片雜交掃描圖片導(dǎo)入Illumina GenomeStudio軟件，得到校正后的數(shù)據(jù)，利用R 語言lumi包進行標準化處理及差異基因篩選（P＜0．05）后，維、漢族膠質(zhì)母細胞瘤全基因組表達譜的比較分析發(fā)現(xiàn)，篩選出顯著差異表達的基因共1 475個，其中表達上調(diào)有669個（44．84%），下 調(diào)有807個（55．16%）（其 中STRC基因?qū)?yīng)2個轉(zhuǎn)錄本，1個轉(zhuǎn)錄本表達上調(diào)1個轉(zhuǎn)錄本表達下調(diào)），統(tǒng)計的差異基因均為公共數(shù)據(jù)庫中收錄的基因。對于篩選出來的差異基因，利用Web Gestalt軟件，對差異基因做GO（Gene Ontology）分析（P＜0．05）。通過統(tǒng)計每個GO條目中差異基因的個數(shù)，利用統(tǒng)計檢驗對差異表達的1 475個基因中做富集分析，計算差異基因富集的顯著性，分析發(fā)現(xiàn)有1 175個基因富集分布在代謝過程、生物調(diào)節(jié)、對刺激反應(yīng)、多細胞的有機過程、細胞交流、細胞增殖等生物過程中。見表1。

表1 差異基因參與的主要生物過程

3 討論

腦膠質(zhì)瘤作為最常見的原發(fā)性腦腫瘤，其中一半以上為惡性度最高的膠質(zhì)母細胞瘤，其惡性度極高，患者即使采用了最為積極的治療手段，中位生存期仍然不容樂觀。研究表明，不同級別的膠質(zhì)瘤的分子改變、用藥以及預(yù)后均有明顯不同［3-4］。近年來，國內(nèi)外對于新疆維、漢族患者腦膠質(zhì)瘤的研究大多停留在TP53、MGMT、VEGF等蛋白表達方面［5-6］，對于膠質(zhì)瘤基因水平及膠質(zhì)母細胞瘤的研究報道較少。新疆維、漢族患者高級別膠質(zhì)瘤在發(fā)病及臨床特點等方面的不同，提示其在基因水平上，可能存在一定的差異性。

從基因水平探究其發(fā)病機制已成為膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域的必然趨勢。和所有惡性腫瘤一樣，膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展也是一系列分子改變的結(jié)果，自1995年Schena等發(fā)表第一篇基因表達譜芯片文章以來，目前基因芯片法已廣泛應(yīng)用于人類多種惡性腫瘤，如卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌等［7］，同樣也應(yīng)用與膠質(zhì)瘤基因表達譜的研究。而對于篩選維、漢族膠質(zhì)母細胞腫瘤的差異性表達，國內(nèi)外尚未見報道。

本研究采用含有47 323個探針對應(yīng)的31 330個基因的mRNA 表達譜芯片檢測了3例維族患者膠質(zhì)母細胞瘤，3例漢族患者膠質(zhì)母細胞瘤的mRNA 基因表達譜情況，發(fā)現(xiàn)差異表達的基因1 475個（4．7%）。經(jīng)過軟件分析，篩選出顯著差異表達（P＜0．05）的1 475個基因中，表達上調(diào)有669個（44．84%），下 調(diào) 有807個（55．16%），其 中 有1個 基 因（STRC）對應(yīng)2個轉(zhuǎn)錄本，1個轉(zhuǎn)錄本表達上調(diào)1個轉(zhuǎn)錄本表達下調(diào)。

篩選出來維、漢族膠質(zhì)母細胞瘤的差異表達基因，涵蓋了膠質(zhì)瘤分子診斷指南中常見分子標記物中的MGMT、TP53、IDH 等［8-9］。通過GO 分析，發(fā)現(xiàn)維、漢族膠質(zhì)母細胞瘤之間的差異表達基因涵蓋了多個生物學(xué)過程，這些差異基因主要參與代謝過程、生物調(diào)節(jié)、對刺激反應(yīng)、多細胞的有機過程等，其中包含小GTP酶調(diào)節(jié)信號通路、Ras信號蛋白通路、神經(jīng)元反應(yīng)蛋白調(diào)節(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成等多個功能節(jié)點。

在基因差異和通路功能方面，維族和漢族膠質(zhì)母細胞瘤既有相同的差異表達基因，又各自有自己特有的差異表達基因。說明膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展中有其腫瘤共同的基因變化，又有民族之間的差異。對維族、漢族兩個民族共同的差異表達基因的研究，有助于我們對膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展的分子機制、信號傳導(dǎo)通路進行進一步的認識；而對兩個民族各自特有的共同差異表達基因的研究有助于我們進一步認識膠質(zhì)母細胞瘤在發(fā)病機制上可能存在民族差異。

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