姜 華 孫成法 褚榮濤 王君祥 周幽心 黃煜倫 謝學(xué)順

1）江蘇常熟市第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科 常熟 215500 2）蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科 蘇州 215006

膠質(zhì)瘤起源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞，是神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的富含血管的實(shí)體腫瘤。雷公藤紅素是我國首先從雷公藤根中提煉的三萜色素類單體，是雷公藤的主要活性成分之一。研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素對血管內(nèi)皮細(xì)胞有較明顯的體外抑制作用，IC50為1．33μg／mL［1］；而且雷公藤紅素通過多個(gè)方面抑制血管新生：雷公藤紅素抑制ECV 的小管形成，并呈劑量依賴性；雞胚尿囊膜血管生成試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其血管生成抑制率達(dá)85．0%［2］；動物實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素抑制荷SHG44膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤生長，而且通過下調(diào)周期蛋白D1及PCNA 的蛋白表達(dá)，對腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控，減緩瘤細(xì)胞增殖［3-4］，但雷公藤紅素抑制血管生成的作用機(jī)制尚不明確。因此，我們進(jìn)一步研究雷公藤紅素抑制血管生成的相關(guān)分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG-44由蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科腦研室自行構(gòu)建并留存。46 只雌性BALB／c裸小鼠，SPF等級，體質(zhì)量（25±3）g，鼠齡5～7周，購自上海實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號：SCXK（滬）2002-0010。飼養(yǎng)于NASA1000 級生物凈化室內(nèi)，按SPF 等級要求管理。二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma Chemical公司，RPMI-1640培養(yǎng)液購自Life Technologics公司，DMEM 培養(yǎng)液購自GIBCO BRL公司，小牛血清購自杭州四季青公司。雷公藤紅素（Celastrol）購自中科院上海藥物研究所，分子式C29H38O4，分子量450，純度＞97%。順鉑由昆明三戊貴金屬藥業(yè)生產(chǎn)。即用型SP 超敏試劑盒及檸檬酸鹽緩沖液（pH 6．0±0．1），CD34、VEGF單克隆抗體，bFGF、VEGFR1、VEGFR2多克隆抗體均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1．2 裸鼠皮下荷瘤模型 復(fù)蘇膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG44，傳代培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。收集處于對數(shù)期生長的細(xì)胞，調(diào)整為密度2×107／mL 的單細(xì)胞懸液懸于不含血清的DMEM 培養(yǎng)基中，抽取細(xì)胞懸液0．5mL，分別接種于6只BALB／c裸鼠右腋部背側(cè)皮下。荷瘤裸鼠飼養(yǎng)于NASA1000級生物凈化室，皮下瘤塊生長至直徑約1．2 cm，進(jìn)行裸鼠腫瘤傳代移植。接種裸鼠40只，2周后腫瘤形成約0．16cm3瘤塊，剔除荷有最大和最小瘤塊的裸小鼠各3只。

1．3 荷SHG-44膠質(zhì)瘤裸鼠的治療 采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方法，將接種成功的34 只荷SHG-44膠質(zhì)瘤裸鼠隨機(jī)分成5組：溶媒對照組（A組），雷公藤紅素按3種濃度4mg／kg（B組）、2mg／kg（C組）、1 mg／kg（D 組）分組給藥，陽性對照順鉑組（E組）按2mg／kg給藥。每周2次，共給藥4周。所有組共投藥4周，以開始投藥時(shí)的所測腫瘤體積為基準(zhǔn)，每隔5 d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤結(jié)節(jié)的最長徑和最短徑。腫瘤體積的計(jì)算公式V＝長徑×短徑×短徑／2。每周稱量荷瘤裸鼠體重以監(jiān)測藥物毒性。28d后斷頸處死剔出腫瘤并測量腫瘤的最長徑和最短徑，病理醫(yī)生檢查每只荷瘤裸鼠肺、肝、腎組織。

1．4 腫瘤抑制率的測定 腫瘤抑制率＝（對照組體積-試驗(yàn)組體積）／對照組體積×100%。

1．5 HE染色及免疫組織化學(xué) 腫瘤標(biāo)本予10%甲醛固定，逐級脫水，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)4μm 石蠟切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗5min×3次，檸檬酸鹽緩沖液（0．01 mol／L，pH∶6．0）微波修復(fù)，室溫冷卻后PBS洗5min×3次，10%正常羊血清封閉10min，滴加稀釋好的第一抗體（工作濃度為1∶100）60min，PBS洗5min×3次，生物素-SP標(biāo)記二抗（即用型）孵育10min，PBS洗5 min×3次，DAB顯色，顯微鏡下觀察3～10 min，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度脫水，二甲苯透明。

1．6 微血管密度（microvesseldensity，MVD）計(jì)數(shù)及免疫組化的染色計(jì)數(shù) （1）微血管密度（MVD）計(jì)數(shù)：參照Weidner微血管計(jì)數(shù)法［5］。血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿呈棕黃色或棕褐色者為CD34陽性細(xì)胞。（2）免疫組化的染色計(jì)數(shù)：染色陽性表達(dá)為境界清楚、突出于背景的棕黃色或棕褐色顆粒。為兼顧染色強(qiáng)度（SI）和陽性細(xì)胞百分比（PP），采用免疫反應(yīng)分?jǐn)?shù)（IRS）表示其表達(dá)水平［6］，IRS＝SI×PP。SI分級：0 級為未見陽性細(xì)胞即陰性；1 級為弱陽性，染色顆粒散在分布，顯色較弱；2級為中度陽性，顯色強(qiáng)度適中；3 級為強(qiáng)陽性，細(xì)胞呈均一棕黃染色。PP分級：0級為陰性；1級≤10%；2級11%～50%；3級51%～80%；4級＞80%。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13 軟件作單因素方差分析（ANOVA），計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間兩兩比較運(yùn)用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0．05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 荷SHG-44膠質(zhì)瘤裸鼠的一般生長情況 各組荷瘤裸鼠生長狀況良好，體質(zhì)量呈增加趨勢；移植瘤體積也呈增大趨勢，但生長速率不同。未觀察到明顯的不良反應(yīng)，如活動遲緩、腹瀉、厭食等癥狀。移植瘤瘤體呈球形或不規(guī)則團(tuán)塊狀，邊界尚清，有活動度，質(zhì)地韌，可漸浸潤皮膚、肌肉，甚至骨骼，部分瘤體皮膚有壞死。見圖1。

圖1 荷SHG-44膠質(zhì)瘤裸小鼠

2．2 雷公藤紅素對荷SHG-44膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤的抑制作用 各組荷SHG-44膠質(zhì)瘤裸鼠的移植瘤測量體積見表1。自異體瘤塊移植后荷瘤裸鼠生長15d，各組皮下移植瘤平均體積已增長至0．16cm3，開始給藥；給藥第1天和第6天，5組移植瘤生長體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝0．685，P＝0．608）。自給藥第11 天開始，空白對照組和雷公藤紅素1 mg／kg組腫瘤生長速率開始加快，各組移植瘤生長體積相比均有顯著性差異（F＝5．501，P＝0．002）。雷公藤紅素4mg／kg組、雷公藤紅素2mg／kg組、雷公藤紅素1 mg／kg組、陽性對照順鉑組的體積抑瘤率分別為35%、26．9%、12．8%、41．4%；與空白對照組相比，雷公藤紅素4 mg／kg組、陽性對照順鉑組的腫瘤生長體積比差異顯著（P＜0．01）；雷公藤紅素2mg／kg組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），并存在劑量依賴性。

表1 荷SHG44膠質(zhì)瘤裸鼠的移植瘤體積 （±s，cm3）

表1 荷SHG44膠質(zhì)瘤裸鼠的移植瘤體積 （±s，cm3）

注：與A組（空白對照組）比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01

組別 n 體積第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天A組 10 0．1677±0．0246 0．2321±0．0547 0．7790±0．1715 1．1999±0．2604 1．7892±0．3676 2．8490±0．3937 B組 6 0．1626±0．0253 0．2014±0．0311 0．3701±0．0747＊＊ 0．6813±0．2454＊＊ 1．0490±0．2425＊＊ 1．8518±0．5492＊＊C組 6 0．1628±0．0252 0．2297±0．0464 0．4958±0．1746＊＊ 0．7957±0．2797＊＊ 1．3750±0．4283＊ 2．0812±0．6170＊D組 6 0．1573±0．0501 0．2486±0．0822 0．6001±0．2836 0．9370±0．2920 1．5416±0．4416 2．4837±0．7376 E組 6 0．1639±0．0284 0．2438±0．0437 0．4845±0．1749＊＊ 0．6733±0．1838＊＊ 0．9806±0．3043＊＊ 1．6683±0．5914＊＊

2．3 雷公藤紅素對荷SHG-44膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤MVD 的影響 見圖2。不同劑量的雷公藤紅素對荷瘤裸鼠移植瘤的MVD 均有影響。

2．4 雷公藤紅素對荷SHG-44膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤的bFGF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達(dá)的IRS 見表2。5 組荷瘤裸鼠移植瘤的VEGFR1的免疫反應(yīng)分?jǐn)?shù)組間比較（LSD法）發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素4mg／kg、2mg／kg與1mg／kg組間比較無顯著差異；VEGFR2組間比較發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素4 mg／kg組與雷公藤紅素1mg／kg組比較差異顯著；bFGF組間比較發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素4mg／kg組與2mg／kg組、1 mg／kg組比較差異顯著。結(jié)果提示不同劑量的雷公騰紅素對荷瘤裸鼠移植瘤的VEGF蛋白表達(dá)沒有影響；雷公藤紅素不同劑量組均能下調(diào)荷瘤裸鼠移植瘤的VEGFR1 蛋白表達(dá)，但還不能認(rèn)為3者之間有差別；雷公藤紅素4mg／kg組和雷公藤紅素2mg／kg組均能下調(diào)荷瘤裸鼠移植瘤的VEGFR2蛋白表達(dá)，且存在劑量依賴性。雷公藤紅素4mg／kg組和陽性對照順鉑組均能下調(diào)bFGF的蛋白表達(dá)。

圖2 雷公藤紅素對荷SHG-44 膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤MVD 的影響

表2 荷SHG-44膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤的bFGF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的免疫反應(yīng)分?jǐn)?shù)（IRS） （±s）

表2 荷SHG-44膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤的bFGF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的免疫反應(yīng)分?jǐn)?shù)（IRS） （±s）

注：與A組（空白對照組）比較，＊P＜0．05，＊＊P ＜0．01

組別 n bFGF VEGF VEGFR1 VEGFR2 A組10 6．00±1．15 3．31±1．27 5．98±1．29 6．13±1．54 B組 6 2．59±0．92＊＊ 2．95±1．15 3．39±1．10＊＊ 3．28±0．86＊＊C組 6 5．08±1．36 3．21±0．45 3．45±0．75＊＊ 4．50±0．94＊D組 6 4．89±1．41 2．58±0．66 4．56±0．91＊ 5．89±2．03 E組 6 4．67±0．79＊ 3．70±1．04 2．83±0．86＊＊5．36±1．14

3 討論

腫瘤的主要生物學(xué)行為特征是無限增殖，其無限增殖的前提是要有新生血管提供營養(yǎng)物質(zhì)，新生血管是實(shí)體腫瘤生長的必備條件［7］。腫瘤血管生成不足可致腫瘤細(xì)胞程序性死亡，達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。MVD 是表示腫瘤血管生成數(shù)量的有效指標(biāo)，膠質(zhì)瘤的微血管密度及形態(tài)結(jié)構(gòu)與其預(yù)后及生物學(xué)行為密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，順鉑組對荷瘤裸鼠移植瘤的微血管密度沒有影響，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。不同劑量的雷公藤紅素與對照組比較均能降低荷瘤裸鼠移植瘤的MVD；雷公藤紅素4 mg／kg 組、雷公藤紅素2 mg／kg組和雷公藤紅素1mg／kg組降低MVD 效果有差別，存在劑量依賴性；其中雷公藤紅素4mg／kg組抑制效果最明顯。可以推斷雷公藤紅素抑制荷瘤裸鼠移植瘤的生長機(jī)制之一是其能降低荷瘤裸鼠移植瘤的微血管密度（MVD）。

Vogelstein和Kinzler研究小組已經(jīng)證實(shí)［8］，腫瘤血管生成和生理狀態(tài)下的血管生成在基因表達(dá)上有明顯不同。這一發(fā)現(xiàn)為血管生成的基礎(chǔ)和臨床研究提供了重要資料。腫瘤血管生成是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，Jain 和Carmeliet提出［9］，腫瘤血管通過出芽、套疊、血管生成擬態(tài)等6種可能機(jī)制而新生。VEGF和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）等均是已知強(qiáng)烈的促血管生成因子。堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）的生物學(xué)作用是通過與其特異性的細(xì)胞表面受體-FGFR 結(jié)合而介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）與內(nèi)皮細(xì)胞上的酪氨酸激酶受體VEGFR 結(jié)合，通過Raf-MEKMAP 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而發(fā)揮其生物學(xué)作用［10-11］。Kubota認(rèn)為應(yīng)用不同的方法封閉或阻斷VEGF／VEGFR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑均可抑制腫瘤的血管生成，進(jìn)而抑制腫瘤的生長［12］。

本文結(jié)果提示，雷公藤紅素對bFGF、VEGFR1、VEGFR2的蛋白表達(dá)有顯著下調(diào)作用，對VEGF蛋白表達(dá)沒有影響。雷公藤紅素影響荷SHG44膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤MVD 的可能原因：（1）下調(diào)腫瘤組織中VEGFR 蛋白表達(dá)，使VEGF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱，明顯降低了VEGF生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮，進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和腔化；由于雷公藤紅素抑制荷瘤裸鼠移植瘤的VEGFR-2 蛋白表達(dá)存在劑量效應(yīng)，更能抑制VEGF／VEGFR2所介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂活性。（2）下調(diào)bFGF的蛋白表達(dá)，對抑制腫瘤血管生成有一定作用。因此，雷公藤紅素抑制荷SHG44膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤生長的機(jī)制之一是其具有抗血管生成的生物活性。

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