肖澎，袁華偉，何桂強(qiáng)，楊吉蓉，吳重德，黃鈞，周榮清，2

1(四川大學(xué) 輕 紡與食品學(xué)院，四川 成都，610065)2(皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都，610065)

4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-Ethylguaiacol，簡稱4-EG)又名4-乙基-2-甲氧基苯酚(4-Ethyl-2-methoxy-phenol)，分子式為C9H12O2，分子量152 Da，具有煙熏及溫和的烤肉味［1-3］，屬醬香型香料，是一種重要的天然呈香化合物。該化合物在醬油、酒等許多食品中得到廣泛應(yīng)用［4-5］。通常通過以下的方法獲得:(1)從天然木油中精餾;(2)由愈創(chuàng)木酚或香莢蘭乙酮人工合成;(3)通過生物轉(zhuǎn)化。精餾提取操作復(fù)雜，成本高，而人工合成所需要的反應(yīng)條件比較苛刻，且因需要劇毒的鋅汞參與反應(yīng)，難以工業(yè)化。生物轉(zhuǎn)化法具有周期短，反應(yīng)條件溫和，價格低廉，無污染，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，已引起各國研究者的高度關(guān)注［6］。

1995年，Duncan等［7］發(fā)現(xiàn)了賦予醬油煙熏氣味的主要原因是Brettanomyces anomalus將小麥麩皮中的阿魏酸轉(zhuǎn)化為4-EG所致。Suezawa［8］探討了Candida屬酵母在含15%NaCl脅迫環(huán)境中將阿魏酸(FA)轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性酚的途徑:首先FA經(jīng)脫羧酶催化轉(zhuǎn)化為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚(4-vinyguaiacol，4-VG)，隨后被還原酶催化轉(zhuǎn)化為4-EG，見圖1。在已發(fā)現(xiàn)微生物中，Pichia anomala、Pichia subpelliculosa、Debaryomyces hansenii及一些Candida屬酵母及Bacillus subtilis和耐鹽的Staphylococcus xylosus等細(xì)菌只是將FA轉(zhuǎn)化為4-VG［9］，目前一些植物乳酸桿菌和腸桿菌可將 FA 轉(zhuǎn)化為4-EG［10-13］。

圖1 4-EG生物合成途徑Fig．1 Biosynthetic pathway of 4-EG

在眾多食品中，4-EG是特性的呈香組分，微生物的生物轉(zhuǎn)化是重要的來源之一，但除了在醬油中應(yīng)用的Candida屬等少數(shù)種屬菌株被確認(rèn)外，其余的缺乏直接證據(jù)。本研究以FA為惟一的碳源，篩選到1株能高效轉(zhuǎn)化FA為4-EG的分離株，根據(jù)分離株生理生化、形態(tài)的研究并結(jié)合16S r DNA序列分析鑒定其種屬關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

1．1．1 樣品來源

醬香型大曲取自郎酒股份有限公司大曲車間。

1．1．2 培養(yǎng)基

①種子培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;②篩選培養(yǎng)基:參見文獻(xiàn)［14］所述方法將阿魏酸添加到VP培養(yǎng)基［13］中，使 FA 含量為 1g/L;③麩皮固體培養(yǎng)基［15］。

1．1．3 主要試劑和儀器

2-辛醇，美國Sigma-Aldrich公司;4-EG標(biāo)準(zhǔn)品，英國Alfa Aesar公司;FA，上海阿拉丁試劑有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:TraceDSQⅡ(Thermo Fisher公司，美國)配備毛細(xì)管色譜柱(TR-5MS，Thermo Fisher公司，美國);電泳儀:PowerPac Basic(Bio-Rad，美國);凝膠成像儀:Gel Doc XR(Bio-Rad，美國);Spectrumlab22PC可見分光光度計(Perkin ElmerTM，美國);高速冷凍離心機(jī):TGL16M(湘麓離心機(jī)儀器有限公司，長沙);光學(xué)顯微鏡:CX31RTSF(Olympas，日本);Biolog全自動微生物鑒定儀(Biolog公司，美國);超聲波細(xì)胞粉碎機(jī):JY-92IIN(新芝生物科技股份有限公司，寧波)。

1.2 菌種分離及篩選

稱取2 g曲粉裝入含有18 mL無菌水的150 mL玻珠三角瓶中，振蕩打散后，置于 80℃熱處理10 min，梯度稀釋后涂布于種子培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)1 d，隨機(jī)挑選單菌落經(jīng)劃線分離為純菌落，接種到斜面培養(yǎng)基上待篩選。

初篩:分離株經(jīng)活化后，分別接入篩選培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)(37℃、130 r/min)6 d后，過濾發(fā)酵液，以2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)，通過GC/MS檢測揮發(fā)組分4-EG及4-VG的相對含量，選出轉(zhuǎn)化率高的菌株進(jìn)行下一步復(fù)篩。

復(fù)篩:將初篩的4-EG高轉(zhuǎn)化率菌株活化，培養(yǎng)成種子菌懸液，接入篩選培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)(37℃、130 r/min)6 d后，GC/MS檢測4-EG及4-VG的相對含量。

1.3 菌株鑒定

1．3．1 菌落及菌體形態(tài)觀察

復(fù)篩的目的菌株，將其菌懸液梯度稀釋后，涂布于牛肉膏-蛋白胨瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)32h，觀察菌落形態(tài);挑單個菌落分別用光學(xué)顯微鏡及掃描電子顯微鏡觀察個體形態(tài)。

1．3．2 生理生化特征

①生理生化性能檢測:根據(jù)Biolog全自動鑒定儀說明書的規(guī)定程序，采用革蘭氏染色陽性的細(xì)菌鑒定板進(jìn)行生理生化性能測定。②耐熱性研究:菌懸液分別接種到牛肉膏-蛋白胨和麩皮固體培養(yǎng)基中，將液態(tài)培養(yǎng)的溫度設(shè)定為30、37、45、50和55℃，培養(yǎng)1 d后，比濁法檢測菌體濃度。固態(tài)培養(yǎng)的溫度設(shè)定為30、37、45、55、65 和70 ℃，培養(yǎng)3 d 后，涂布計數(shù)法檢測菌落數(shù)量。

1．3．3 菌種16S rDNA鑒定

離心收集培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的菌體，采用Bacterial DNA Kit試劑盒提取總DNA。提取得到的總DNA采用0．6%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度。采用細(xì)菌通用引物(27f:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;1492r:5’-GGCTA CCTTGTT ACGACT T-3’)對總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，送至上海生工公司進(jìn)行測序［16］。將測序得到的16S rDNA序列在eztaxon上進(jìn)行BLAST比對后，與GenBank數(shù)據(jù)庫做相似性分析。

1.4 轉(zhuǎn)化特性的研究

1．4．1 篩選菌株不同組分轉(zhuǎn)化性能的研究

培養(yǎng)至對數(shù)期的培養(yǎng)液經(jīng)冷凍離心分離(4℃，10 000 r/min)5min，分別收集上清液和菌團(tuán)，分別考察菌體及胞內(nèi)外組分對4-EG轉(zhuǎn)化的影響:1)以含1g/L FA的無菌水為空白樣。2)用含1g/L FA的無菌蒸餾水將菌團(tuán)制成菌懸液(OD600=1，pH=7);3)同2)的菌懸液，經(jīng)超聲處理(總時間30 min，超聲時間2 s，間隔時間4 s，功率390 W)破碎細(xì)胞后加入FA使其濃度為1 g/L;4)上清液中加入FA，濃度為1 g/L;5)發(fā)酵液加入FA，濃度為1g/L。分別在37℃、130 r/min條件下培養(yǎng)2 d，檢測4-EG的含量。

1．4．2 不同組分酶活的測定

分別考察胞內(nèi)組分及胞外組分中脫羧酶及還原酶的酶活力大小，反應(yīng)體系由50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7．0)和1g/L FA或者1g/L 4-VG組成，分別將1．4．1中的上清液及破壁菌液濃縮3倍，以10%(V/V)加入到反應(yīng)體系中，于37℃反應(yīng)1 h。反應(yīng)體系中4-VG及4-EG的產(chǎn)量由GC/MS測定。1個脫羧酶(還原酶)酶活力單位的定義:每分鐘1 μmol 4-VG(4-EG)的產(chǎn)量。

1．4．3 發(fā)酵溫度對轉(zhuǎn)化的影響

培養(yǎng)至對數(shù)期的培養(yǎng)物，調(diào)節(jié)菌體濃度為OD600=1，培養(yǎng)基pH=7，加入FA使其質(zhì)量濃度為1 g/L，分別取50 mL裝入250 mL三角瓶中，置于30℃、37℃、41℃、45℃、50℃、55℃ 培養(yǎng)2 d，測定4-EG的含量。

1.5 代謝產(chǎn)物GC/MS分析

發(fā)酵液在4°C下10 000 r/min離心5 min，收集上清液，加入5倍量的二氯甲烷及一定量的2-辛醇(內(nèi)標(biāo))超聲萃取15min，經(jīng)分液漏斗得到有機(jī)相，重復(fù)提取2次。向有機(jī)相中加5 g無水Na2SO4，12 h，過濾，在冰浴中經(jīng)氮?dú)獯祾邼饪s至0．5 mL供GC/MS檢測分析［12，17］。

色譜條件:進(jìn)樣口溫度為250℃，初始溫250℃;分流模式，分流比10∶1;升溫程序，初始溫度80℃，保持2 min，以10℃/min升到210℃;載氣:高純氦氣，流速為1 mL/min。質(zhì)譜條件:連接口溫度:250℃;電離方式:EI;電子能量:70 eV;離子源溫度:200℃;掃描范圍:40～500 amu，檢出物經(jīng)GC/MS標(biāo)準(zhǔn)譜庫(NIST05)檢索及標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析 ［D4］

2.1 4-EG產(chǎn)生菌株篩選

102株分離株接種到篩選培養(yǎng)基中，37℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，檢測揮發(fā)性組分，以揮發(fā)性組分中的4-EG相對含量為基準(zhǔn)，初篩的6株高產(chǎn)菌進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果如表1。D-31菌株發(fā)酵液中的揮發(fā)性組分中4-VG及4-EG含量、4-EG摩爾轉(zhuǎn)化率均較高。

表1 菌株復(fù)篩結(jié)果Table 1 Results of strain rescreening

2.2 菌株鑒定

2．2．1 菌落及細(xì)胞形態(tài)觀察

D-31經(jīng)活化后，梯度稀釋涂布在牛肉膏-蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)32 h，觀察菌落形態(tài)(圖2B)，菌落表面粘稠，邊緣處乳白色一圈突起，類似火山口，呈不規(guī)則形態(tài)。菌體形態(tài)為桿狀，單生，革蘭氏陽性，產(chǎn)芽孢，芽孢中生，菌體形態(tài)的電鏡圖如圖2A所示。

圖2 D-31菌株形態(tài)Fig．2 Morphology of strain D-31

2．2．2 生理生化特征

采用95種碳源的革蘭氏染色陽性細(xì)菌鑒定板對其生理生化性能測定，分析結(jié)果表明，該菌株與Bacillus subtilis相似度是100%，與其他菌屬相似率均為0%，結(jié)合菌落、菌體形態(tài)觀察結(jié)果并參考《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》(第二版)，初步判斷為Bacillus subtilis。該菌株液體培養(yǎng)，最適生長溫度是37℃，溫度在45～50℃能生長，高于55℃時，基本停止生長(圖3)。固態(tài)培養(yǎng)，適合生長溫度范圍是30～45℃之間，最適溫度:37℃，同樣大于55℃時，停止生長，部分菌體死亡，大部分以芽孢形式存活(表2)。

圖3 液態(tài)發(fā)酵D-31菌株在不同溫度下的生長情況Fig．3 Effect of temperature on the growth of D-31 strain in submerged fermentation

表2 固態(tài)發(fā)酵D-31菌株不同溫度的生長情況Table 2 Effect of temperature on the growth of D-31 strain in solid fermentation

2．2．3 16S rDNA 鑒定

D-31菌株16SrDNA核苷酸序列全長為1257 bp，在GenBank中登錄號為KF702383，經(jīng)多序列同源性分析，得到12個有100%同源性的菌株，系統(tǒng)發(fā)育樹中D-31菌株與Bacillus subtilis(AMXN01000021)屬同一分枝 (圖4)，確定為 Bacillus subtilis，暫編號為D-31。

圖4 菌株D-31基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．4 Phylogenetic tree based on partial 16S rDNA sequences of strain D-31

2.3 轉(zhuǎn)化特性的研究

2．3．1 發(fā)酵液不同組分轉(zhuǎn)化能力

發(fā)酵物、活菌體和上清液均能將FA轉(zhuǎn)化為4-EG(圖5)，但上清液的轉(zhuǎn)化效率高于細(xì)胞碎片和菌體組分，而菌懸液的催化活性最高。催化組分的性質(zhì)及機(jī)理需進(jìn)一步研究。

圖5 不同類型轉(zhuǎn)化形成4-EG的情況Fig．5 Formation of 4-EG in different types

2．3．2 不同組分酶活力的測定

測定其胞內(nèi)組分及胞外組分中脫羧酶及還原酶的酶活力結(jié)果如表3所示，上清液組分中的4-VG還原酶酶活力高于細(xì)胞碎片洗滌物中的。但前者的FA脫羧酶酶活小于后者，可能是胞外中間產(chǎn)物4-VG迅速轉(zhuǎn)化為4-EG及其他代謝物，無法積累所致。該結(jié)果表明B．subtilis D-31是FA脫羧酶和4-VG還原酶共同催化FA轉(zhuǎn)化為4-EG，與先前的報道一致［8］。

2．3．3 發(fā)酵溫度對轉(zhuǎn)化的影響

由圖6可知，目的菌株轉(zhuǎn)化阿魏酸生成4-EG的最適發(fā)酵溫度為45℃，在30～45℃，隨著溫度的增加，代謝產(chǎn)物4-EG的產(chǎn)量呈遞增趨勢，超過45℃后，4-EG產(chǎn)量迅速減少。

圖6 溫度對4-EG轉(zhuǎn)化產(chǎn)量的影響Fig．6 Effect of temperature on transformation of 4-EG

2.4 代謝產(chǎn)物分析

發(fā)酵上清液經(jīng)GC/MS檢測，檢出19種揮發(fā)性組分，如丙酮酸甲酯、2，3-丁二醇、異丁酸、4-EG、4-VG、油酸乙酯等(見圖7)，占總檢出峰的56．13%。其中，酯類占0．8%，醇類占1．41%，烷烴類占2．31%，酸類占0．28%，酚類物質(zhì)占51．18%。這19種揮發(fā)性組分中4-VG和4-EG所占總峰比例最高，分別為45．64%［(0．64±0．03)g/L］和5．28%［(26．38±3．39)mg/L］。

表3 不同組分酶活力測定Table 3 Enzyme activity assay from different components

圖7 D-31菌株發(fā)酵液芳香組分的總離子流圖Fig．7 Total ion chromatorgraphy of aromatic components in fermentation broth

3 討論

本研究利用FA為唯一碳源的定向培養(yǎng)基，以揮發(fā)性組分圖譜及4-EG相對含量為基準(zhǔn)，從醬香型大曲中分離出1株具有高效轉(zhuǎn)化阿魏酸形成4-EG能力的菌株。通過菌落及菌體形態(tài)觀察，以及生理生化性能的結(jié)果初步鑒定為Bacillus subtilis，16S rDNA的遺傳鑒定證實(shí)。對FA轉(zhuǎn)化4-EG的特性的初探結(jié)果表明，參與轉(zhuǎn)化作用的是胞外上清液的某些組分。雖然已有文獻(xiàn)報道在耐鹽酵母的胞外組分是以FA脫羧酶及4-VG還原酶為主的混合物質(zhì)［5］，但具有轉(zhuǎn)化FA為4-EG特性的Bacillus subtilis的轉(zhuǎn)化機(jī)制未見報道，需要進(jìn)一步研究。

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