李玉妹，劉春鳳，李崎

1(江南大學(xué)教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學(xué)釀酒科學(xué)與工程研究室，江蘇無錫，214122)

原花青素(procyanidins，PC)是一種由黃烷-3-醇單體縮合而成的聚多酚類物質(zhì)，因在酸性介質(zhì)中加熱可產(chǎn)生相應(yīng)的花色素而得名。由于其聚合體還表現(xiàn)出單寧特性，因此也稱為縮合單寧［1］，廣泛存在于各種植物的核、皮或種籽等部位［2］，因其來源不同，其結(jié)構(gòu)、組成及其生理活性也不同。目前，應(yīng)用范圍最廣泛的為葡萄籽原花青素。作為多酚類物質(zhì)原花青素具有極強(qiáng)的抗氧化和自由基清除能力，能有效地清除HO·、O2-·、DPPH·等自由基［3-4］。

原花青素為極性物質(zhì)，萃取溶劑可選用甲醇、丙酮、乙醇、乙酸乙酯等極性溶劑，提取溶劑對原花青素的選擇性及產(chǎn)物的組成有不同影響［5］。乙酸乙酯極性最小，對原花青素的提取不完全;甲醇和丙酮對原花青素均有較好的提取性能，但二者均有毒性，且研究表明，原花青素在甲醇中可能解聚［6］。乙醇是常用的提取溶劑，溶解性能好，穿透細(xì)胞能力強(qiáng)，能增強(qiáng)溶質(zhì)的穩(wěn)定性，價格低廉，且毒性小。原花青素在pH＞5的條件下不穩(wěn)定，會發(fā)生解聚合，而低聚原花青素(如原花青素B2、B5)，在pH＜4的環(huán)境下也會自氧化解聚，所以提取溶劑的pH值需控制在4～5的弱酸性內(nèi)［7］。

啤酒中原花青素主要來源于麥芽和酒花，其中70%來自麥芽，30%來自酒花［8］。一方面作為抗氧化物質(zhì)，原花青素對抑制啤酒老化有積極影響，能延長啤酒保鮮期，增加啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性［9］;另一方面，作為多酚類物質(zhì)，原花青素易與蛋白結(jié)合沉淀，影響啤酒儲存過程中的膠體穩(wěn)定性［10］。本文通過對原料麥芽中原花青素提取條件的研究，建立了適宜提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用多酚酒花顆粒，札一香花和青島大花為玉門拓璞酒花公司提供;進(jìn)口澳麥及國產(chǎn)麥芽為市購;(+)-兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司;AB-8大孔吸附樹脂購自天津南開合成有限公司;甲醇、香草醛、無水乙醇、濃HCl等試劑為分析純;實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水，使用前經(jīng)0.45 μm無機(jī)膜過濾。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HB-10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA公司;Laboport真空抽濾機(jī)，德國KNF公司;KQ3200DB型數(shù)控超聲儀，昆山超聲儀器公司;AL204電子天平，MettlerToledo公司;離心機(jī)，德國Eppendorf公司;玻璃層析柱(φ10 mm ×200 mm)，上海生工。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原花青素質(zhì)量濃度測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:精確稱取兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品配制1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別取 0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL定容至10 mL。利用濃鹽酸香草醛法［12］測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸線性方程為y=603.38x+4.2152(其中y為兒茶素質(zhì)量濃度μg/mL，x為吸光度值)，R2=0.999 1。

樣品測定:取待測液1 mL，依次加入4 g/100 mL香草醛-甲醇溶液3 mL，濃HCl1.5 mL，混勻后于20℃水浴15 min，在500 nm處測吸光度，(以1 mL甲醇代替待測液作為空白對照)。操作過程避光進(jìn)行。得到吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程，得到原花青素濃度。

1.3.2 麥芽原花青素有機(jī)溶劑提取

分別精確稱取1 g進(jìn)口澳麥麥芽，按浸提溫度(℃)、浸提液乙醇體積分?jǐn)?shù)(%)、料液比(g∶mL)、最佳浸提時間(h)優(yōu)化提取條件，提取過程在弱酸性條件下進(jìn)行(調(diào)節(jié)pH=4)。粗提液過濾后定容至25 mL，采用香草醛濃鹽酸法測吸光度，以原花青素濃度為指標(biāo)，考察不同提取條件下的提取效果。

1.3.3 AB-8大孔吸附樹脂動態(tài)吸附條件選擇

AB-8大孔吸附樹脂經(jīng)過預(yù)處理后裝入φ10 mm×200 mm的玻璃層析柱中，裝柱體積13 mL。將用最佳提取條件下萃取的麥芽原花青素粗提液(調(diào)節(jié)pH=4)通入樹脂，控制流速，分部收集流出液(1 mL/管)，當(dāng)流出液中原花青素濃度達(dá)到上樣濃度1/10［13］時停止上樣，計(jì)算動態(tài)吸附量。分別考察上樣流速和上樣液濃度對樹脂吸附麥芽原花青素的影響，確定合適的上樣吸附條件。

吸附通量=上樣液濃度(mg/mL)×流出液體積(mL)

1.3.3 AB-8大孔吸附樹脂動態(tài)解吸條件選擇

將用最佳提取條件萃取的麥芽原花青素粗提液，按確定的最佳吸附條件進(jìn)行吸附，用乙醇進(jìn)行洗脫。分部收集流出液，測定其中原花青素質(zhì)量濃度，計(jì)算解吸率。考察洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)、解吸速率及洗脫液乙醇體積對解吸效果的影響。

1.3.4 酒花中原花青素提取方法［11］

2 結(jié)果與討論

2.1 麥芽中原花青素有機(jī)溶劑萃取條件的確定

2.1.1 溫度對原花青素提取效果的影響

用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇作為提取溶劑，料液比1∶20，提取時間1.5 h，研究提取溫度對原花青素提取效果的影響。結(jié)果如圖1所示。在25～55℃內(nèi)隨著溫度的升高，提取得率略有上升，但是，隨著溫度的繼續(xù)上升，70℃時提取得率略有下降，這是因?yàn)樵诟邷叵露喾宇愇镔|(zhì)不穩(wěn)定，容易氧化，使得得率有所下降。但當(dāng)溫度處于萃取溶劑沸騰溫度時，原花青素質(zhì)量濃度明顯增加，分析原因，可能是因?yàn)槿軇┓序v時，增加了料液接觸面積，并且在沸騰時溶劑迅速脫氧，有效減少了原花青素的氧化損耗。選擇85℃作為提取溫度。

圖1 提取溫度對提取效果的影響Fig.1 Effect of temperature on the extraction

2.1.2 乙醇濃度對原花青素提取效果的影響

用乙醇作為提取溶劑，提取溫度85℃，料液比1∶20(g∶mL)，提取時間 1.5 h，研究乙醇濃度對原花青素提取效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙醇濃度對提取效果的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction

多酚類物質(zhì)含有酚羥基，有一定的極性，提取溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)不同影響了提取溶劑的極性，進(jìn)而影響對多酚類物質(zhì)的溶解度及選擇性，所以只有在合適的乙醇濃度下才會有較高的原花青素得率。在乙醇體積分?jǐn)?shù)10% ～60%內(nèi)，隨著乙醇濃度的升高提取液原花青素的濃度逐漸升高，而且實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，低濃度乙醇的提取液呈糊狀比較難過濾，而且濾液較混濁。而高濃度乙醇對多酚類物質(zhì)有較好提取效果的同時對蛋白和多糖有較強(qiáng)的沉淀能力，提取液也更容易過濾。60%和70%乙醇都有較好的提取效果，綜合考慮后，選擇60%乙醇作為提取溶劑濃度。

2.1.3 料液比對原花青素提取效果的影響

用60%乙醇作為提取溶劑，提取溫度85℃，提取時間1.5 h，研究提取料液比對原花青素提取效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對提取效果的影響Fig.3 Effect of the ratio of material to liquid on the extraction

麥芽中原花青素的提取是溶質(zhì)溶劑化的過程，在一定范圍內(nèi)，隨著提取溶劑的增加，能被浸取出來的物質(zhì)就越多。而隨著提取溶劑用量的繼續(xù)增加，擴(kuò)散達(dá)到平衡，再增加溶劑量也不會使浸出物質(zhì)有所增加。同時，提取溶劑用量的增大，對后面的過濾、濃縮會造成較大的負(fù)擔(dān)。料液比1∶20(g∶mL)時，已經(jīng)有較高的原花青素濃度，綜合考慮選擇1∶25(g∶mL)左右作為提取料液比。

2.1.4 提取時間對原花青素提取效果的影響

用60%乙醇作為提取溶劑，提取溫度85℃，料液比1∶25(g∶mL)，研究提取時間對原花青素提取效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時間對提取效果的影響Fig.4 Effect of extraction tine on the extraction

結(jié)果表明，在0.5～1.5 h內(nèi)，隨著提取時間的延長，原花青素提取得率有所增加，浸提時間短，與蛋白質(zhì)、纖維素結(jié)合的酚類物質(zhì)來不及溶出，提取時間過長，由于多酚類物質(zhì)穩(wěn)定性不好，容易發(fā)生分解破壞，所以1.5 h后，隨著時間延長，提取液原花青素濃度呈下降趨勢。選擇提取效果最好的1.5 h作為提取時間。

2.2 麥芽原花青素提取的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)(表1)，結(jié)果及分析見表2。

表1 原花青素提取的正交實(shí)驗(yàn)L9(34)因素水平Table 1 Factors and levels in the L9(34)orthogonal experiments array for extraction of procyanidins

表2 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果分析Table 2 Arrangement and result analysis of orthogonal experiments

由表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析可以看出，各因素對原花青素提取效果的影響由大到小依次為乙醇濃度＞溫度＞提取時間＞料液比，極差分析得到的最佳提取條件為溫度85℃、乙醇濃度60%、料液比1∶30、時間1.5h。但是結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)，料液比1∶25(g∶mL)時，已經(jīng)有較高的原花青素濃度，此時繼續(xù)增加提取溶劑用量，原花青素濃度提高并不明顯。同時，提取溶劑用量的增大，對后面的過濾、濃縮會造成較大的負(fù)擔(dān)。所以選擇1∶25(g∶mL)作為提取料液比。因此得出原花青素最佳提取條件為，溫度85℃、乙醇濃度60%、料液比1∶25、提取時間1.5h。以此為條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3 提取條件驗(yàn)證Table 3 Confirmation of extraction conditions

由表3可知，在已確定的提取條件下，麥芽原花青素的得率穩(wěn)定，且與正交實(shí)驗(yàn)最大值相近，說明提取方法可行。

2.3 AB-8大孔吸附樹脂動態(tài)吸附條件確定

有機(jī)溶劑萃取的麥芽原花青素提取液，雜質(zhì)含量較高，需進(jìn)一步上柱進(jìn)行純化分離，研究表明，AB-8樹脂的性質(zhì)不但對大麥多酚類極性物質(zhì)的選擇性較強(qiáng)，吸附量大，而且容易被解吸，回收率高［14］。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，原花青素在AB-8樹脂上具有很好的吸附解吸效果［11］，所以選擇AB-8樹脂對麥芽粗提液進(jìn)一步分離純化。

2.3.1 上樣流速對吸附量的影響

控制上樣濃度0.57 mg/mL，比較不同上樣流速下AB-8大孔樹脂的吸附通量。由圖5可知，AB-8大孔吸附樹脂對麥芽原花青素的吸附通量，隨上樣流速的增加而減少，這是因?yàn)樯蠘恿魉俚淖兓绊懥巳苜|(zhì)向樹脂內(nèi)表面的擴(kuò)散，進(jìn)而影響吸附效果。隨著上柱流速增大，樣品溶液中的原花青素和樹脂沒有足夠長的時間接觸，溶質(zhì)分子來不及擴(kuò)散到樹脂內(nèi)表面，使樹脂的吸附量下降。但是雖然較低的流速對吸附有利，但流速過低，操作時間長，造成過多的工作負(fù)擔(dān)，所以選擇上樣流速0.5 mL/min左右較適宜。

圖5 上樣流速對吸附通量的影響Fig.5 Effect of sample flow velocity on adsorption capacity

2.3.2 上樣濃度對吸附量的影響

控制上柱速率為0.5 mL/min，考察不同上樣料液濃度下的動態(tài)吸附量，結(jié)果見圖6。

由結(jié)果可知，AB-8吸附麥芽原花青素的能力隨著上樣濃度的提高而增加。當(dāng)料液濃度為0.57 mg/mL時，濕AB-8樹脂對麥芽原花青素的動態(tài)吸附量為5.72 mg，當(dāng)料液濃度上升到0.96 mg/mL時，吸附量為7 mg。表明一定范圍內(nèi)原花青素的進(jìn)樣濃度越高，樹脂的吸附量越大。但原花青素濃度處于較高水平時，與之競爭吸附的雜質(zhì)量也增加，原花青素在樹脂內(nèi)部的擴(kuò)散能力會降低，將加重濃縮工藝負(fù)荷，造成由濃度過高引起的上樣困難，同時增大控制其他上樣條件恒定的難度。而且由于原花青素上柱吸附前需要靜置澄清，靜置沉淀后原花青素濃度越高，沉淀過程中的損失越多［15］，所以上樣時原花青素不宜采用較高濃度。選擇上柱料液濃度在0.57 mg/mL。

圖6 上樣濃度對吸附量的影響Fig.6 Effect of sample concentration on adsorption capacity

2.4 AB-8大孔吸附樹脂動態(tài)解吸附條件確定

2.4.1 洗脫劑濃度的選擇

在已經(jīng)確定的動態(tài)吸附條件下，洗脫流速1 mL/min，洗脫體積70 mL，考察洗脫劑乙醇濃度對洗脫效果的影響，結(jié)果如圖7，圖8所示。

圖7 乙醇濃度對洗脫效果的影響Fig.7 Effect of ethanol concentration on desorption properties

圖8 不同乙醇濃度AB-8樹脂動態(tài)解吸曲線Fig.8 Elution curve of procyanidins absorbed on AB-8 resin with different ethanol concentration

如圖7所示，隨著乙醇濃度的增加，麥芽原花青素的解吸效率有所增加，50%，60%，70%(v/v)乙醇解吸回收率分別為:93.6%，95.2%和95.9%。可以看到60%乙醇已經(jīng)有較高的回收率，且如圖8所示，低濃度乙醇洗脫時的洗脫曲線有拖尾現(xiàn)象，洗脫不完全，50%和70%乙醇的解吸曲線峰形集中，無拖尾現(xiàn)象。但是洗脫劑乙醇濃度逐漸增加的同時，洗脫過程中柱體中產(chǎn)生的氣泡也會增加，影響洗脫效果，綜合考慮選擇60%乙醇作為洗脫劑濃度。

2.4.2 洗脫流速的選擇

在已經(jīng)確定的動態(tài)吸附條件下，60%乙醇作為洗脫劑，洗脫體積70 mL，考察洗脫流速對洗脫效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示。

圖9 洗脫流速對洗脫效果的影響Fig.9 Effect of desorption velocity on desorption properties

由圖9可知，洗脫流速對洗脫效果有一定影響，洗脫效果隨洗脫流速的提高總體呈下降趨勢，這是流速對洗脫劑與吸附在大孔樹脂上的多酚類物質(zhì)交換產(chǎn)生的影響。洗脫速度過快，洗脫劑來不及與被吸附的原花青素充分作用，使得洗脫效率下降。綜合考慮洗脫效率和操作時間，采用1 mL/min的流速。

2.4.3 洗脫液體積的選擇

按已確定吸附條件吸附，60%乙醇作為洗脫劑，洗脫流速1 mL/min，洗脫劑用量對解吸效果的影響如圖10所示。

圖10 洗脫液乙醇體積對洗脫效果的影響Fig.10 Effect of elution ethanol volume on desorption properties

由圖10可知，65 mL時原花青素基本完全洗脫。因此，從節(jié)約成本和減少濃縮負(fù)擔(dān)出發(fā)，洗脫劑用量確定為65 mL。

2.5 麥芽和酒花中原花青素含量比較

為進(jìn)一步研究啤酒中原花青素的組成與性質(zhì)，根據(jù)已經(jīng)確定的麥芽原花青素提取純化條件，并且利用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的酒花中原花青素提取純化方法，進(jìn)行有機(jī)溶劑萃取，再經(jīng)過AB-8大孔吸附樹脂純化富集。對2種麥芽，3種酒花中的原花青素含量進(jìn)行了比較，結(jié)果如圖11所示。

圖11 不同種類麥芽和酒花原花青素含量比較Fig.11 Comparison of procyanidins from different malt and hops

由結(jié)果可知，多酚顆粒酒花的原花青素總含量最多(37.71 mg/g)，這與酒花的制作工藝有關(guān)，多酚顆粒酒花富集了多酚的含量，所以原花青素含量較高，青島大花和扎一香花的原花青素含量分別為29.14 mg/g和28.01 mg/g，沒有明顯差別。而3種酒花中原花青素含量均明顯高于國產(chǎn)麥芽(1.88 mg/g)和進(jìn)口澳麥(2.34 mg/g)，其中進(jìn)口澳麥原花青素含量略高于國產(chǎn)麥芽，差別不明顯。但在啤酒釀造過程中，原料酒花的添加量很少，成品啤酒中原花青素類物質(zhì)有70%仍來源于麥芽。

3 結(jié)論

通過對進(jìn)口澳麥中原花青素的提取純化條件研究，建立了麥芽中原花青素有機(jī)溶劑提取最佳條件為:60%乙醇，提取溫度為85℃，此時乙醇處于沸騰狀態(tài)，料液比1∶25，提取時間為1.5 h。并利用AB-8大孔吸附樹脂進(jìn)行進(jìn)一步層析純化，裝柱體積為13 mL，得到動態(tài)吸附條件:樣品濃度0.57 mg/mL，上樣流速0.5 mL/min，動態(tài)解吸條件:65 mL 60%乙醇在洗脫流速1 mL/min下洗脫，可得最佳洗脫效果。此時回收率可達(dá)95.2%，所得原花青素樣品干基百分含量(純度)可達(dá)67.58%。

對2種麥芽3種酒花中原花青素含量進(jìn)行比較，多酚顆粒酒花的原花青素總含量最多，為37.71 mg/g，其次是青島大花和扎一香花，原花青素含量分別為29.14 mg/g和28.01 mg/g，兩者沒有明顯差別。3種酒花中原花青素含量均明顯高于國產(chǎn)麥芽(1.88 mg/g)和進(jìn)口澳麥(2.34 mg/g)，其中進(jìn)口澳麥原花青素含量略高于國產(chǎn)麥芽，差別不明顯。

［1］ Porter L J，Hrstich L N，Chan B G.The conversion of procyanidins and prodelphinidins to cyanidin and delphinidin［J］.Phytochemistry，1985，25(1):223-230.

［2］ Monagas M，Quintanilla-López J E，Gómez-Cordovés C，et al.MALDI-TOF MS analysis of plant proanthocyanidins［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2010，51(2):358-372.

［3］ Da Silva J M R，Darmon N，F(xiàn)ernandez Y，et al.Oxygen free radical scavenger capacity in aqueous models of different procyanidins from grape seeds［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1991，39(9):1 549-1 552.

［4］ Bagchi D，Garg A，Krohn R L，et al.Oxygen free radical scavenging abilities of vitamins C and E，and a grape seed proanthocyanidin extract in vitro［J］.Research Communications in Molecular Pathology and Pharmacology，1997，95(2):179.

［5］ Jayaprakasha G K，Singh R P，Sakariah K K.Antioxidant activity of grape seed(Vitis vinifera)extracts on peroxidation models in vitro［J］.Food Chemistry，2001，73(3):285-290.

［6］ Jerumanis J.Separation and identification of flavanoids by high-performance liquid chromatography(HPLC)［C］//Proceedings of the Congress-European Brewery Convention.1979，17:309-319.

［7］ Zhu Q Y，Holt R R，Lazarus S A，et al.Stability of the flavan-3-ols epicatechin and catechin and related dimeric procyanidins derived from cocoa［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50(6):1 700-1 705.

［8］ Li H J，Deinzer M L.Structural identification and distribution of proanthocyanidins in 13 different hops［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54(11):4 048-4 056.

［9］ Miky sˇka A，Hrabak M，Ha?ková D，et al.The role of malt and hop polyphenols in beer quality，flavour and haze stability［J］.Journal of the Institute of Brewing，2002，108(1):78-85.

［10］ Callemien D，Collin S.Involvement of flavanoids in beer color instability during storage［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55(22):9 066-9 073.

［11］ 單巖，李永仙，鄭飛云，等.酒花中原花青素的提取純化研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(012):272-276.

［12］ 鮑俊竹，陳月坤，徐桂花.測定葡萄籽提取物中原花青素含量的方法［J］.農(nóng)業(yè)科學(xué)研究.2005，26(1):43-45.

［13］ 劉碩謙，劉仲華，黃建安，等.大孔吸附樹脂分離富集水皂角多酚［J］. 食品科學(xué)，2004，25(3):55-60.

［14］ 劉清，李虎虎，姚惠源，等.大孔吸附樹脂分離富集大麥多酚的研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(11):98-102.

［15］ 孫蕓.葡萄籽原花青素聚合度與功效關(guān)系的研究［D］.無錫:江南大學(xué)，2004.