徐永霞，劉瀅，姜程程，張朝敏，儀淑敏，勵建榮

(渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州，121013)

大菱鲆，俗稱歐洲比目魚，在我國又稱“多寶魚”，是原產(chǎn)于土耳其北部沿岸的一種具有重要經(jīng)濟價值的鲆鰈魚物種。自1992年引進至今，大菱鲆養(yǎng)殖已經(jīng)發(fā)展成為年產(chǎn)量超過6萬噸的海水養(yǎng)殖支柱產(chǎn)業(yè)，養(yǎng)殖產(chǎn)區(qū)主要集中在黃海北部和環(huán)渤海等北部沿海地區(qū)［1］。大菱鲆肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)價值豐富，深受消費者喜愛。目前，大菱鲆相關(guān)的研究主要集中于餐桌飲食［2］、免疫學(xué)［3］、基因組學(xué)［4］、養(yǎng)殖和保鮮等方面，而對風味物質(zhì)的研究較少。

近年來，針對于有復(fù)雜介質(zhì)或含協(xié)同效應(yīng)揮發(fā)性成分的樣品而建立的氣味指紋技術(shù)已運用于水產(chǎn)品風味方面的檢測［5］。固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)技術(shù)是一種新型的無溶劑樣品處理方法，集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體，簡單方便，將SPME和氣質(zhì)聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)聯(lián)用能夠?qū)]發(fā)物進行準確定性和定量［6］。而電子鼻(electronic nose，E-nose)作為一種集分析、識別、檢測復(fù)雜揮發(fā)性成分功能于一體的新型儀器，具有客觀、準確、重復(fù)性好及無損等優(yōu)點［5］。本研究采用電子鼻和SPME-GC-MS技術(shù)對大菱鲆魚肉中的揮發(fā)性成分進行分析和鑒定，比較了其新鮮和腐敗2個階段揮發(fā)性氣味的差異，期望為大菱鲆風味的深入研究及品質(zhì)控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮養(yǎng)殖大菱鲆，購于錦州市林西水產(chǎn)市場，質(zhì)量約600～800 g/尾;C8～C20正構(gòu)烷烴標準品，Sigma公司;NaCl、MgO均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;平板計數(shù)瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PEN3便攜式電子鼻系統(tǒng)，德國AIRSENSE公司;Agilent 7890N/5975氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)儀，美國Agilent公司;固相微萃取裝置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、20 mL頂空鉗口樣品瓶，美國Supelco公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;Foss Kjeltec 8400，瑞典福斯集團公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理方式

將鮮活大菱鲆采用碎冰凍死，清洗瀝干后用蒸煮袋包裝于4℃冰箱中貯藏直至腐敗。

1.3.2 測定指標及方法

感官評定:參照 Duflos［7］等人的方法并稍作修改，由6位經(jīng)過培訓(xùn)的感官評定人員對魚的氣味、質(zhì)地、外粘液、眼球和魚鰓等進行評分，各指標的感官評定分值在0～3分之間;分值越低表明樣品品質(zhì)最好，0分代表最佳品質(zhì)，3分代表最差品質(zhì)。

細菌總數(shù)(TVC)的測定:根據(jù)GB/T 4789.2-2010的方法進行平板計數(shù)［8］。

揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測定:參照FOSS方法［9］，采用自動定氮儀測定。結(jié)果表示為mg N/100 g魚肉。

1.3.3 電子鼻檢測

準確稱取經(jīng)絞碎的魚肉1.0 g于25 mL的燒杯中，迅速用保鮮膜封口后置于4℃冰箱中靜置30 min。電子鼻測定時間為100 s，頂空溫度25℃，內(nèi)部流量300 mL/min，進樣流量300 mL/min。每個樣品重復(fù)測定3次。PEN3型便捷式電子鼻傳感器性能描述見表1。

1.3.4 GC-MS分析

固相微萃取:準確稱取經(jīng)絞碎的魚肉3.0 g于20 mL頂空瓶中，加入6 mL飽和NaCl溶液及磁轉(zhuǎn)子，用聚四氟乙烯隔墊密封，于60℃磁力攪拌器中加熱平衡15 min。用已活化好的DVB/CAR/PDMS 50/30 μm萃取頭(270℃活化60 min)頂空吸附40 min后，將萃取頭插入GC進樣口，解吸5 min。每個樣品重復(fù)實驗2次。

氣相色譜條件:HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣口溫度為250℃，不分流模式進樣;載氣為He，流速1.0 mL/min;程序升溫:柱初溫40℃，保持3 min，以3℃/min升至100℃，再以5℃/min升至230℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件:色譜-質(zhì)譜接口溫度280℃，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃;離子化方式:EI;電子能量70 eV;質(zhì)量掃描范圍30～550(m/z)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

電子鼻數(shù)據(jù)分析:取穩(wěn)定后第84 s～88 s這5 s的數(shù)據(jù)信息進行主成分分析(PCA)。

表1 PEN3型便捷式電子鼻傳感器性能描述Table 1 Properties of sensor on PEN3 electronic nose

GC-MS數(shù)據(jù)分析:樣品中揮發(fā)性成分的定性分析采用計算機譜庫(NIST 11/Wiley 7.0)進行檢索，并利用C8～C20正構(gòu)烷烴的保留時間計算各個色譜峰的保留指數(shù)，確認揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)組成。揮發(fā)性成分的定量分析采用峰面積歸一化法。

2 結(jié)果與討論

2.1 常規(guī)新鮮度評價指標分析

新鮮及腐敗魚肉的感官評分、細菌總數(shù)和TVBN值如表2所示。整個貯藏過程中大菱鲆的感官評分值逐漸升高，說明其品質(zhì)逐漸下降，在20d時感官品質(zhì)不可接受。由表2可知，隨貯藏時間的延長菌落總數(shù)逐漸增加，貯藏20 d時已超過國標規(guī)定的衛(wèi)生標準［10］。TVB-N是評價魚類新鮮度的重要指標，當TVB-N值達到30 mg/100 g被認定為貨架期終點［11］。大菱鲆貯藏過程中的TVB-N值逐漸升高，第20天的TVB-N值為44.34 mg N/100 g。通過以上指標的測定結(jié)果表明，貯藏20 d的魚肉已達到腐敗階段。

表2 新鮮及腐敗大菱鲆魚肉新鮮度指標測定結(jié)果Table 2 Results of freshness indices of fresh and spoiled turbots

2.2 電子鼻檢測

采用電子鼻檢測分析新鮮和腐敗魚肉樣品的氣味差異，結(jié)果如圖1和2所示。由圖1可以看出，新鮮和腐敗魚肉樣品的風味輪廓之間存在顯著差異，響應(yīng)值變化較為明顯的傳感器由大到小分別是R(7)、R(9)、R(6)和R(2)，這說明相比新鮮魚肉樣品，腐敗魚肉中無機硫化物R(7)、芳香成分和有機硫化物R(9)、烷烴類R(6)和氮氧化合物R(2)的含量明顯升高，從而使得腐敗樣品中呈現(xiàn)出臭味。同時采用SPSS19.0軟件分析新鮮及腐敗魚肉風味對10個傳感器的響應(yīng)值可得出2種樣品的相關(guān)性系數(shù)為0.814，說明其差異性較顯著。為進一步表征新鮮和腐敗魚肉樣品之間氣味的差異，采用PCA法對這些氣味指紋數(shù)據(jù)進行數(shù)理統(tǒng)計。由圖2可知，第一主成分(PC1)貢獻率達到99.87%，PC1和PC2貢獻率之和達到99.98%，能較好地反映原始高維矩陣數(shù)據(jù)的信息，說明電子鼻能有效區(qū)分新鮮和腐敗魚肉的氣味變化。該方法的分析結(jié)果與感官評分、菌落總數(shù)和TVB-N值的變化相一致。此外，用GC-MS對揮發(fā)性風味成分進行進一步分析和鑒定。

圖1 新鮮及腐敗魚肉樣品的氣味感應(yīng)強度雷達圖Fig.1 The radar chart of odour in fresh and spoiled turbot samples

圖2 新鮮和腐敗魚肉樣品的PCA分析Fig.2 PCA plot of fresh and spoiled turbot samples based on electronic nose signals

2.3 GC-MS分析結(jié)果

新鮮及腐敗的大菱鲆魚肉中揮發(fā)性成分組成及其相對含量見表3。分別鑒定出27、28種揮發(fā)性物質(zhì)，主要包括醛類、酮類、醇類、酯類、烴類、芳香族和胺類化合物等。圖3為新鮮和腐敗魚肉中檢測到的各類揮發(fā)性物質(zhì)相對含量及組成。由圖3可知，醛類、酮類和醇類物質(zhì)在新鮮魚肉中相對含量較高，而腐敗魚肉中胺類物質(zhì)的相對含量較高。非常新鮮的魚通常具有柔和的、淺淡的、令人愉快的氣味，而鮮魚的這種氣味通常是由醛類、醇類和醇類引起的［12］。

2.3.1 羰基化合物

羰基化合物包括醛類和酮類物質(zhì)，在水產(chǎn)品氣味特征中起重要作用。醛類是大菱鲆主要的揮發(fā)性物質(zhì)之一，在新鮮和腐敗的魚肉中分別檢測到5、7種醛類物質(zhì)，其相對含量分別為25.64%和14.94%。醛類物質(zhì)主要由多不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生，且閾值很低，尤其是C6～C12的飽和醛類物質(zhì)的閾值極低，對魚類總體氣味特征有重要影響［13］。其中己醛具有青草味、腥味，庚醛具有果香，壬醛具有魚腥味，苯甲醛具有令人愉快的堅果香。由表3可知，這4種醛類物質(zhì)在新鮮魚肉中的相對含量明顯高于腐敗魚肉。3-甲基丁醛僅在腐敗魚肉中檢出，這種物質(zhì)可能是由Strecker降解或微生物活動產(chǎn)生［14］。研究報道［15］，煮熟的去皮蝦肉冷藏期間感官品質(zhì)的劣變與3-甲基丁醛的產(chǎn)生密切相關(guān)。實驗中共檢出4種酮類物質(zhì)，在新鮮魚肉中的相對含量較大，尤其是2，3-辛二酮和(E，E)-3，5-辛二烯-2-酮。酮類物質(zhì)具有特殊的香氣，由于其閾值較高，對魚肉氣味的貢獻相對較?。?6］，但酮類對腥味具有增強作用，尤其是烯酮類化合物。

2.3.2 醇類化合物

醇類物質(zhì)主要是由脂肪酸氧化酶作用于多不飽和脂肪酸衍生而來的。大菱鲆中檢出的醇類含量也較大，在新鮮和腐敗魚肉中分別為24.79%和18.32%。醇類物質(zhì)一般閾值較高，對整體氣味的貢獻較小。但不飽和醇閾值相對較低，具有蘑菇香氣和類似金屬味，對魚肉風味有一定作用。其中1-戊烯-3-醇和1-辛烯-3-醇在新鮮魚肉中的含量遠高于腐敗魚肉，研究發(fā)現(xiàn)，這2種醇類化合物可能是熏制鮭魚鮮度指示物［17］。而3-甲基-1-丁醇僅在腐敗魚肉中檢出，且相對含量較高。研究報道，3-甲基-1-丁醇與微生物的代謝有關(guān)，可能是魚類腐敗變質(zhì)的潛在揮發(fā)性指示物［14］。

圖3 新鮮及腐敗大菱鲆魚肉揮發(fā)性成分的比較Fig.3 Comparison of volatiles compounds in fresh and spoiled turbot flesh

2.3.3 烴類及芳香族化合物

由表3可知，實驗中檢測到較多的烴類物質(zhì)(烯烴類和烷烴類)。烯烴類化合物在一定條件下可形成醛和酮，是產(chǎn)生魚腥味的潛在因素。其中D-檸檬烯在新鮮和腐敗2個階段均被檢出，且相對含量較大。檸檬烯類物質(zhì)可能產(chǎn)生于周圍的環(huán)境中［18］。C8～C19的烷烴類物質(zhì)氣味閾值較高，因此對魚肉整體風味的貢獻較小。此外，在新鮮和腐敗魚肉中均檢測到3種芳香族化合物，包括對傘花烴、萘和丁羥甲苯，這類化合物可能來自環(huán)境中的污染物。其中，萘已在龍蝦、扇貝和蟹中檢出［19］。

表3 新鮮及腐敗大菱鲆魚中揮發(fā)性成分的GC-MS分析結(jié)果Table 3 Volatile compounds of fresh and spoiled turbot flesh analyzed by GC-MS

2.3.4 胺類及其他化合物

魚體中胺類化合物主要是由于各種氨基酸在細菌的脫羧作用下生成的，這些物質(zhì)一般都有腥臭味［12］。由表3可知，在腐敗魚肉中檢測出三甲胺，且含量很高。三甲胺是三甲胺氧化物在細菌酶的作用下產(chǎn)生的，呈現(xiàn)出令人不愉快的氨味并廣泛存在于水產(chǎn)品中，通常作為評價水產(chǎn)品新鮮度的一個重要指示物［20］。實驗中共檢出4種酯類物質(zhì)，這類物質(zhì)在新鮮魚肉中的相對含量高于腐敗魚肉。此外，在腐敗魚肉中檢出乙酸。乙酸主要由乳酸菌作用產(chǎn)生的，會產(chǎn)生非常強烈的令人不愉快的汗味，Jónsdóttir等人研究認為乙酸為熏制鮭魚腐敗等級的評價指標之一［21］。

3 結(jié)論

通過測定大菱鲆在4℃冷藏過程中的感官、菌落總數(shù)和TVB-N值等指標的變化，確定魚肉在貯藏20d時已達到腐敗階段。電子鼻結(jié)果顯示，新鮮和腐敗魚肉的氣味差異明顯，電子鼻數(shù)據(jù)PCA分析可以很好地區(qū)分新鮮和腐敗魚肉樣品，該方法的分析結(jié)果與傳統(tǒng)指標的變化相一致;GC-MS分析結(jié)果表明，在新鮮和腐敗魚肉中分別檢測到27和28種揮發(fā)性物質(zhì)，其中醛類、酮類和醇類物質(zhì)在新鮮魚肉中的含量較高，而胺類物質(zhì)在腐敗魚肉中含量較高。其中己醛、庚醛、(E，E)-2，4-庚二烯醛、1-戊烯-3-醇和 1-辛烯-3-醇等物質(zhì)在新鮮魚肉中的含量明顯高于腐敗魚肉，可能作為表征魚肉新鮮的揮發(fā)性指示物，而3-甲基丁醛、3-甲基-1-丁醇、三甲胺僅在腐敗魚肉中檢出，且相對含量較高，可能作為魚肉腐敗的標志物。

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