吳滿剛，莊濤，王小蘭，吳雪燕，陳洋洋，于海，葛慶豐，汪志君

(揚州大學食品科學與工程學院，江蘇揚州，225127)

真空冷凍干燥法制備凍干發(fā)酵劑是將需要保藏的微生物細胞懸浮液凍結(jié)后，在真空條件下使冰升華，最終達到干燥的目的［1］。此方法主要是根據(jù)微生物生理、生化特點，干燥后微生物的代謝緩慢、生長繁殖受到抑制，達到休眠狀態(tài)，從而保持菌株原有特性。凍干發(fā)酵劑主要優(yōu)點是:活菌含量高、保藏期長、發(fā)酵性能穩(wěn)定、易于運輸?shù)?，在西方發(fā)達國家已得到廣泛應用［2］。凍干發(fā)酵劑的制備工藝大致可分為3步:增殖培養(yǎng)、收集濃縮和冷凍干燥［3］。

現(xiàn)有報道［4］發(fā)酵香腸中的乳酸菌以彎曲乳桿菌、植物乳桿菌、清酒乳桿菌和短小乳桿菌為主。Stahnke［5］報道，植物乳桿菌大多情況下為優(yōu)勢菌，少數(shù)情況下清酒乳桿菌占優(yōu)勢，乳酸菌生長不一致可能與香腸配方和發(fā)酵條件不同有關。戊糖片球菌、清酒乳桿菌最能適應發(fā)酵香腸的制作環(huán)境，短小乳桿菌不能適應特定的環(huán)境，后期生長較慢，植物乳桿菌最適宜作為乳酸菌發(fā)酵劑用于香腸生產(chǎn)。本試驗以植物乳桿菌為目標菌株，通過增殖培養(yǎng)，再濃縮收集后篩選凍干保護劑，從而最大限度地提高菌體存活率，旨在為研制高效凍干發(fā)酵劑提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和設備

1.1.1 主要材料

脫脂乳、番茄、胡蘿卜、平菇，均為市售優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品。

濃H2SO2、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、碘化汞、硫酸銨、磺基水楊酸等均為分析純;酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖等均為生化試劑。

菌種:L2植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)MRS 液體培養(yǎng)基［6］。

(2)脫脂乳培養(yǎng)基:脫脂奶粉加蒸餾水制成濃度為14%的脫脂乳液，115℃，滅菌10 min，冷卻后使用。

(3)各種增殖培養(yǎng)基:在MRS液體培養(yǎng)基基礎上添加不同生長因子。

番茄汁：新鮮番茄→清洗→熱燙(90～95℃，3～5 min)→榨汁→過濾→定容(500 g制成1 L番茄汁)→調(diào)pH 6.4→過濾除菌備用。

玉米汁：玉米粉→稱重→加水煮沸10 min→過濾→定容(500 g制成1 L玉米汁)→調(diào)pH 6.4→過濾除菌備用。

胡蘿卜汁：新鮮胡蘿卜→洗凈→去皮及根梢→稱重→切片→加水煮沸10 min→榨汁→過濾→定容(500 g制成1 L胡蘿卜汁)→調(diào)pH 6.4→過濾除菌備用。

平菇汁：新鮮平菇→洗凈→去根→稱重→切片→加水煮沸10 min→榨汁→過濾→定容(500 g制成1 L平菇汁)→調(diào)pH 6.4→過濾除菌備用［7-8］。

1.1.3 儀器和設備

EPS300電泳儀，上海UNICO公司;高速冷凍離心機:5804R，北京艾澤信科技有限公司;KDN-04A蛋白質(zhì)測定儀，上海貝特儀電設備廠;WFJ2000分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司;75 μm Car/PDMS復合式萃取頭，美國Supelco公司;Trace氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)，美國Finnigan公司;755S紫外-可見分光光度計，上海棱光技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的活化

將植物乳桿菌活化2次，以3%接種量將活化液接入裝有100 mL MRS液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，35℃搖床培養(yǎng)24 h備用。

1.2.2 植物乳桿菌增殖因子的單因素試驗

獲得乳酸菌大量生長的培養(yǎng)基是制備濃縮型凍干發(fā)酵劑的前提，乳酸菌發(fā)酵劑的理論活菌數(shù)要求在109～1010CFU/mL，乳酸菌在MRS液體培養(yǎng)基上的活菌濃度并未達到理想水平，所以還必須在基礎培養(yǎng)基上進行營養(yǎng)強化，以便獲取較高的菌體生物量［9］。

針對乳酸菌生長的營養(yǎng)需求，在基礎培養(yǎng)基配方上添加不同的增殖因子，將MRS液體培養(yǎng)基活化過的植物乳桿菌按3%接種于添加增殖因子的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后測定活菌數(shù)。初步篩選出番茄汁(8%)、胡蘿卜汁(8%)、香菇汁(8%)、玉米汁(8%)、CaCO3(0.5%)、卵磷脂(1%)、大豆低聚糖(1%)、甘露糖(1%)等進行單因素實驗，選擇增菌效果較為顯著的增殖因子進行下一步實驗。

1.2.3 植物乳桿菌增殖因子的正交試驗

在MRS液體培養(yǎng)基中添加初步篩選出的對植物乳桿菌增殖作用明顯的增殖因子，采用L9(34)正交試驗設計配制培養(yǎng)基，通過分析正交試驗結(jié)果，確定各成分的最佳濃度，獲得優(yōu)化增菌培養(yǎng)基配方。菌株經(jīng)過活化后，以3%接種量分別接種于上述增菌培養(yǎng)基中，35℃恒溫培養(yǎng)24 h，檢測培養(yǎng)后的活菌數(shù)。

1.2.4 菌體細胞濃縮分離條件的選擇

參照山麗杰［10］的方法，計算離心損失率、存活率和收得率，每組實驗做3個平行，統(tǒng)計分析并檢驗處理組之間差異顯著性，從而選擇最佳的離心參數(shù)。

由(1)、(2)、(3)式得出：

離心收得率/%=離心存活率/% ×(1-離心損失率/%)

1.2.5 菌體懸浮液濃度及凍干厚度的選擇

參照鄧鵬超［11］方法選擇最佳濃度的懸浮基質(zhì)以及最佳凍干厚度。

1.2.6 凍干時間和含水量的關系研究

在無菌操作條件下，將凍干菌粉轉(zhuǎn)移到無菌恒重的小培養(yǎng)皿中，精確稱重，然后將樣品置于105℃烘干至恒重，計算凍干菌粉的含水量:

1.2.7 凍干保護劑及其復合配方的優(yōu)化篩選

將植物乳桿菌活化2次，以3%接種量接入增殖培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，將菌體懸浮于等體積的10%脫脂乳中，混勻，計數(shù)。將不同保護劑配成一定濃度的溶液，分別取1 mL脫脂乳的菌懸液和1 mL凍干保護劑到凍干瓶中(厚度為0.5 cm)，真空冷凍干燥，凍干后加入1 mL無菌水復溶，稀釋涂布，計算活菌數(shù)，分別選取海藻糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、明膠、L-谷氨酸鈉、半胱氨酸、抗壞血酸、甘油、山梨醇、蛋白胨等保護劑進行單因素多水平實驗［14］，篩選出凍干保護效果好的單個保護劑，進一步研究保護劑的復配效果。

保護劑的復配試驗:先配制10%脫脂乳，每10 mL體積分裝試管，分別將初篩出的4種保護劑加入脫脂乳中，配制成不同濃度組合的復合保護劑，混勻，等量溶解離心后的菌體，充分混勻，按2 mL(凍干厚度0.5 cm)的量加入凍干瓶中，進行真空冷凍干燥。

1.2.8 植物乳桿菌凍干存活率的計算

按照熊澤［6］的方法對凍干菌粉復水處理，再參照韓德權［15］方法計算凍干存活率:

式中:C1為凍干前1 mL菌液的活菌數(shù)，CFU/mL;C2為凍干后1 mL復水菌液的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.9 濃縮型凍干菌粉成品特性研究

將增殖培養(yǎng)液4 000 r/min離心10 min收獲菌體，用生理鹽水洗滌，重復2次，加入原菌液體積1/10的復合保護劑(濃縮倍數(shù)按實際需要而定)，混合均勻，以2 mL分裝凍干瓶中，預凍，真空冷凍干燥36 h，得濃縮型凍干菌粉，4℃保藏。精確稱取1.000 0 g凍干菌粉，溶于10 mL無菌生理鹽水中，取1 mL稀釋平板計數(shù)，從而換算出1 g凍干菌粉的含菌量。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌增殖因子的單因素試驗

根據(jù)植物乳桿菌的營養(yǎng)需要，在MRS液體培養(yǎng)基的基礎上，添加各增殖因子后，35℃培養(yǎng)24 h，測定菌液的活菌數(shù)，單因素試驗結(jié)果見圖1。

圖1 不同生長因子對菌體增殖的影響Fig.1 Effect of different growth factors on the cell growth

由圖1可以看出，在基礎培養(yǎng)基中添加生長因子能提高植物乳桿菌活菌數(shù)(CaCO3除外)。由LSD均值多重比較分析可得，添加CaCO3的實驗組活菌數(shù)與CK組相比無顯著性差異(P＞0.05)。但有報道認為菌體在富鈣培養(yǎng)基中能夠增強其抗凍性［16-17］，因此選擇CaCO3作為增菌鹽類，其余實驗組與CK組相比活菌數(shù)增加顯著(P＜0.05)。添加胡蘿卜汁和香菇汁的實驗組增菌效果顯著大于(P＜0.05)其他實驗組，這是由于香菇汁中含有大量的真菌多糖及豐富的維生素，胡蘿卜汁中含有大量的維生素、胡蘿卜素和礦物質(zhì)離子，能很好地滿足植物乳桿菌的生長。但添加胡蘿卜汁和香菇汁的兩組處理組之間差異不顯著(P＞0.05)，考慮到香菇汁成本相對較高，所以選擇胡蘿卜汁為增菌因子。其次，番茄汁實驗組增菌效果和卵磷脂、大豆低聚糖、甘露糖實驗組均無顯著性差異(P＞0.05)，考慮材料價格和來源故選擇番茄汁。綜合考慮最終選擇胡蘿卜汁、番茄汁和CaCO3進行下一步實驗。

2.2 乳酸菌增殖因子的正交試驗

通過上述的單因素試驗，選用胡蘿卜汁、番茄汁和CaCO3為試驗因素，設計L9(34)正交試驗，以獲得培養(yǎng)基最佳配方，其因素及水平如表1所示。

表1 增菌培養(yǎng)基各物質(zhì)的正交因素水平表L9(34)Table 1 Factors and levels of L9(34)orthogonal experiment

按照表1設計的增菌因子的正交因素水平表進行L9(34)正交分析實驗，吸取0.2 mL活化后的菌液涂布在添加增殖因子的培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)，試驗重復3次，取平均數(shù)，結(jié)果如表2。方差分析結(jié)果見表3。

表2 增菌培養(yǎng)基的L9(34)正交分析實驗結(jié)果Table 2 Results of L9(34)orthogonal experiment

表3 方差分析表Table 3 Test of analysis of variance

從表2看出，以活菌數(shù)為直觀分析指標，通過比較R值，各因素對目標值影響順序為A＞C＞B。表3顯示，A因素水平的不同對活菌數(shù)有顯著性影響(P＜0.05)，B和C因素水平的不同對活菌數(shù)無顯著性影響(P＞0.05)。因此，從表2中選擇平均數(shù)大的最佳水平 A2、B2、C3組合成最優(yōu)組合 A2B2C3，與實驗組最佳吻合，即胡蘿卜汁(8%)、番茄汁(8%)和CaCO3(0.75%)，活菌數(shù)為2.68×109CFU/mL。

2.3 菌體細胞濃縮分離條件的選擇

為了得到較高的含菌量，通過離心濃縮使菌體與代謝產(chǎn)物分開，形成適于冷凍干燥的懸浮液，從而提高冷凍干燥存活率。在離心分離過程中［18］，一方面，離心力機械作用以及溫度和基質(zhì)pH值等因素的影響，會造成部分菌體死亡;另一方面，部分菌體必然殘留在上清液中造成損失。若離心工藝掌握不當，將直接導致發(fā)酵劑的活菌含量下降。為此，本實驗研究離心力、離心時間對菌體存活率的影響，其結(jié)果如表4。

表4 不同離心條件對植物乳桿菌離心收得率的影響Table 4 Effect of different centrifugal conditions on harvesting rate of L.plantarum

表4結(jié)果表明，隨著轉(zhuǎn)數(shù)的增加和時間的延長，離心損失率總體呈現(xiàn)減小的趨勢，離心損失率最大的是3 000 r/min離心5 min，損失率最小的是6 000 r/min，15 min。這表明離心力越小、離心時間越短，損失率越高;增大離心力和延長離心時間，均可顯著降低損失率。由離心存活率可見，6 000 r/min，15 min離心存活率最低，離心存活率最高的是4 000 r/min，10 min。離心收得率是衡量離心效果的最終體現(xiàn)，它與離心存活率成正比，而與離心損失率成反比。從經(jīng)濟角度出發(fā)，盡量選取較小離心力和較短離心時間，離心收得率最高的是4 000r/min，10 min。

2.4 菌體懸浮基質(zhì)和凍干厚度的選擇

脫脂乳屬于大分子蛋白質(zhì)類，方便易得，是廣泛使用的菌體懸浮基質(zhì)，對菌體起到凍干保護作用。凍干發(fā)酵劑物料層厚度(即凍干厚度)也會影響凍干時間和凍干效果［19］。將增殖培養(yǎng)后的菌液按最佳離心參數(shù)離心收集菌體，添加等量的不同濃度(8%、10%、12%、14%)的脫脂乳作為菌體懸浮基質(zhì)且分裝成不同厚度的凍干瓶，真空冷凍干燥后，測其凍干存活率，選擇最佳懸浮基質(zhì)的濃度和凍干厚度，每組實驗做3個平行，取平均值，結(jié)果如表5所示。

表5 脫脂乳的不同濃度和凍干厚度對菌體凍干存活率的影響Table 5 Effect on livability of cell by different consistency and thickness of skim milk after freezing-drying

從表5可知，添加脫脂乳基礎保護劑與無菌水的對照組相比，脫脂乳濃度的不同對菌體凍干存活率有極顯著性影響(P＜0.01)，凍干厚度的不同對菌體凍干存活率無顯著性影響(P＞0.05)，不加脫脂乳的無菌水對照組的菌體存活率僅為20%以內(nèi)，絕大多數(shù)菌體在凍干過程中死亡，而添加脫脂乳保護劑的凍干存活率最低為36.728%，最高達到56.173%，保護效果明顯，通過LSD均值多重比較分析可得，脫脂乳濃度為8%、10%、12%、14%的實驗組凍干存活率與對照組均有極顯著性差異(P＜0.01)，脫脂乳濃度為10%的實驗組凍干存活率與8%和12%的實驗組有顯著性差異(P＜0.05)，而脫脂乳濃度為12%和14%的實驗組凍干存活率之間差異不顯著(P＞0.05)，綜合分析得出，保護效果最好的脫脂乳濃度為10%，其次為12%的濃度，最差為14%的濃度，分析原因可能是14%的脫脂乳濃度較大，固形物較多，溶液相對較黏稠，凍干過程中不利于水分的揮發(fā)，導致較多冰晶的形成，從而增大菌體的死亡率。從凍干厚度來看，10%和12%脫脂乳濃度的不同凍干厚度中，均為0.5 cm的厚度凍干存活率最高，而且通過直觀觀察，相同的凍干時間，凍干厚度為0.25 cm的凍干菌粉空隙較大，結(jié)構疏松，黏壁嚴重，凍干厚度為0.75 cm的凍干菌粉較為濕潤，凍干不完全。所以初步選擇0.5 cm進行下一步凍干時間的研究。

2.5 凍干時間和含水量的關系研究

凍干時間和含水量的關系見表6。

表6 不同凍干階段的菌粉含水量Table 6 The moisture content of powder of different stages of freeze-dried

利用真空冷凍干燥技術生產(chǎn)活菌制劑有利于菌種的保藏。研究表明，凍干發(fā)酵劑的含水量為1.5%～3.0%為宜［20］。如果含水量＞3.0%，發(fā)酵劑貯藏穩(wěn)定性降低;而含水量＜1.5%，細胞的凍干死亡率提高［21］。因此，保證凍干發(fā)酵劑的含水量，必須嚴格掌握真空干燥時間。如表6所示，菌粉凍干前32 h含水量顯著性降低(P＜0.05)，凍干處理36 h后，含水量降到3%以下，隨后下降趨勢變緩，所以在本實驗室凍干設備條件下，凍干處理時間選定為36 h左右。

2.6 凍干保護劑及其復合配方的優(yōu)化篩選

冷凍和干燥兩個過程會造成部分微生物細胞的損傷、死亡及某些酶蛋白分子的鈍化［22］。凍干保護劑是影響凍干發(fā)酵劑活力最重要的外部因素，也是采用凍干法制備高效濃縮發(fā)酵劑研究的技術關鍵。選擇海藻糖、蔗糖、麥芽糊精、明膠、谷氨酸鈉、抗壞血酸、甘油、山梨醇等食品級生化材料作為單因子保護劑，采用質(zhì)量分數(shù)為10%脫脂乳為懸浮基質(zhì)進行單因素實驗，每組做3個平行，取平均值，結(jié)果如表7所示。

由表7中凍干后活菌數(shù)的相關數(shù)據(jù)進行方差分析得，各種保護劑對凍干后活菌數(shù)應有顯著性差別，糖類物質(zhì)對菌體凍干保護效果最佳，其中10%海藻糖實驗組凍干后活菌數(shù)顯著高于(P＜0.05)其他實驗組，存活率達66.67%，從動力學角度看，海藻糖能有效促進非晶形或玻璃狀固體形成［23］，從而減少冰晶的形成，起到防止細胞損傷的作用，海藻糖通過氫鍵與脂質(zhì)雙分子層的脂類或蛋白質(zhì)表面的水分子相連，降低了脂類由液晶向凝膠相轉(zhuǎn)移的溫度，從而起到保護作用，其次為麥芽糖，存活率為63.17%，谷氨酸鈉處理組的存活率也較高為61.32%，而半胱氨酸、甘油以及抗壞血酸實驗組與CK組之間無顯著性差異(P＞0.05)，對菌體的凍干保護效果不佳。

表7 凍干保護劑的單因素實驗結(jié)果Table 7 Results of different cryoprotectant factors

不同的保護劑對不同菌種的保護效果不同，單一的保護劑并不能滿足冷凍干燥的要求，所以抗凍保護劑一般都是按一定配方混合使用。復配保護劑中的各種成分在冷凍干燥中均發(fā)揮著各自的作用，相互間又具有協(xié)同效應，同時微生物細胞結(jié)構和大小存在差異性，只有復配保護劑中各保護劑的比例及濃度達到協(xié)調(diào)時，才能達到最佳的保護效果。在上述單因素保護劑的研究基礎上選用海藻糖(A)、麥芽糖(B)、谷氨酸鈉(C)進行優(yōu)化，設計L9(34)正交試驗，其因素及水平如表8。以10%脫脂乳作為菌體懸浮基質(zhì)，在這基礎上添加各種濃度的保護劑，測定凍干前后的活菌數(shù)，每組實驗做3個平行，計算菌體凍干存活率，結(jié)果見表9。方差分析結(jié)果見表10。

表8 復合凍干保護劑的正交因素水平Table 8 Factors and levels of L9(34)orthogonal experiment

表9 復合凍干保護劑正交分析實驗結(jié)果(L934)Table 9 Results of L9(34)orthogonal experiment in cryoprotectant

表10 方差分析表Table 10 Test of analysis of variance

從表9的實驗數(shù)據(jù)和分析結(jié)果可以看出，以凍干后菌體存活率為測試指標，通過比較R值大小，各因素對目標值影響大小順序為A＞B＞C。表10方差分析結(jié)果表明，A和B因素水平的不同，其凍干存活率差異顯著(P＜0.05)，因此選擇平均數(shù)大的最佳水平A2和B2。但C(谷氨酸鈉)因素水平不同，其凍干存活率差異不顯著(P＞0.05)，綜合考慮節(jié)約成本，C(谷氨酸鈉)選擇濃度最低的水平即8%。則最優(yōu)組合為A2B2C1，該組合在試驗方案中不存在，因此，將最優(yōu)水平A2B2C1與試驗方案中凍干存活率最高的第6號試驗的水平組合A2B3C1進行驗證試驗，結(jié)果見表11。

表11 兩種組合保護劑對冷凍干燥的保護效果Table 11 The protective effects of two combinations of protective agent for freeze-drying

由表11可以看出，A2B3C1組合的保護劑用于植物乳桿菌冷凍干燥，活菌數(shù)為3.71×109CFU/mL，菌體存活率達到75.43%，綜合得到保護劑的最佳組合為:海藻糖(10%)、麥芽糖(12%)、谷氨酸鈉(8%)。

2.7 濃縮型凍干菌粉成品特性研究

對最終凍干菌粉成品進行分析，1 mL復水菌液的活菌數(shù)為5.93×1010CFU/mL，則10 mL菌液的活菌數(shù)為5.93×1011CFU/mL，因為1 g凍干粉溶解于10 mL無菌水中，即凍干菌粉成品濃度為5.93×1011CFU/g。

3 結(jié)論

本實驗以植物乳桿菌為發(fā)酵菌株，優(yōu)化出植物乳桿菌增殖培養(yǎng)基的組成為:在MRS液體培養(yǎng)基的基礎上添加8%胡蘿卜汁、8%番茄汁、0.75%CaCO3，在此增殖培養(yǎng)基上活菌數(shù)能達2.68×109CFU/mL以上。采用離心法收集菌體，研究離心條件對菌體收得率的影響，主要考慮離心力和離心時間這2個因素，對離心前菌懸液、離心后上清液以及離心后菌體進行菌落計數(shù)，最終得出菌體最佳收集條件為4 000 r/min離心10 min。選用脫脂乳做為菌體懸浮基質(zhì)可有效提高凍干存活率，研究脫脂乳濃度以及凍干厚度2個因素對凍干存活率的影響，結(jié)果表明，脫脂乳最佳濃度為10%，最佳凍干厚度為0.5 cm，且菌體凍干36 h后，其水分含量可滿足儲藏要求。本實驗通過單因子篩選和正交實驗優(yōu)化，最終得到復合凍干保護劑為:海藻糖(10%)、麥芽糖(12%)、谷氨酸鈉(8%)，活菌數(shù)為3.71×109CFU/mL，凍干存活率可達75.43%。濃縮10倍凍干成品濃度為5.93×1011CFU/g。本研究探索了發(fā)酵肉制品凍干發(fā)酵劑的制備條件，提高了菌體凍干存活率，為凍干肉品發(fā)酵劑在我國的推廣應用提供了理論基礎。

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