李延華，孟岳成，陳杰

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州，310018)

乳是哺乳動(dòng)物分泌的提供給后代的營養(yǎng)源，其中包含乳蛋白質(zhì)、乳脂肪、乳糖、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，同時(shí)乳中也存在一系列生物活性物質(zhì)。乳中生物活性物質(zhì)包括:源自乳蛋白水解的生物活性肽，存在形式是蛋白質(zhì)某一區(qū)域呈現(xiàn)的，通過蛋白水解消化而釋放并激活的生物活性肽;乳清中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白、過氧化物酶、溶菌酶;乳脂肪中的乳脂肪球膜蛋白、共軛亞油酸;生長因子、激素和細(xì)胞活素類［1］。

近年來，有關(guān)牛乳中生物活性成分的種類及功能研究較為全面，已明確了不同生物活性成分的具體生物功能。然而，乳制品在加工過程中不可避免的會(huì)對(duì)乳體系中功能性成分的活性、結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。熱處理是不同乳制品生產(chǎn)過程中不可或缺的工藝手段，盡管已有研究表明，添加保護(hù)劑可以減少某些生物活性成分在熱處理過程中的熱失活現(xiàn)象，但加熱一定會(huì)導(dǎo)致生物活性成分發(fā)生活性降低、變性或者激活，進(jìn)而影響乳制品中功能性活性成分的生理作用，評(píng)估熱處理對(duì)乳中生物活性成分的影響具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 熱處理過程中乳鐵蛋白的生物活性和分子結(jié)構(gòu)的變化

1.1 乳鐵蛋白的含量與生理功能

乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)是鐵與糖蛋白結(jié)合的產(chǎn)物，常乳中LF含量范圍為0.004～0.271 mg/mL，平均為0.101 mg/mL［2］，當(dāng) LF 失去鐵使鐵飽和度在5%以下時(shí)，為缺鐵型乳鐵蛋白(apo-lactoferrin，apo-LF)，而當(dāng)LF結(jié)合鐵使鐵飽和度大于85%，為鐵飽和乳鐵蛋白(holo-lactoferrin，holo-LF)［3］。研究表明 LF具有抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)鐵吸收、促進(jìn)骨重建和抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收等功能［4-5］。

1.2 乳鐵蛋白生物活性的熱穩(wěn)定性

大量研究表明，LF的熱穩(wěn)定性與pH緊密相關(guān)。Ruegg等發(fā)現(xiàn)，牛乳LF在pH6.6，65～69℃時(shí)開始失活［6］。Abe等研究發(fā)現(xiàn)，牛乳apo-LF在酸性條件下比較穩(wěn)定，pH 4.0酸性條件下，采用90℃加熱5 min后LF的抗原活性、鐵結(jié)合力、抑菌活性幾乎無變化;采用70℃預(yù)熱3 min，然后進(jìn)行UHT殺菌(130℃、2 s)發(fā)現(xiàn)鐵結(jié)合能力僅損失3%，LF在酸性條件下較耐熱，在中性和堿性條件下會(huì)發(fā)生渾濁和凝膠化［7］。然而，Sreedhara等指出，在 pH 2.0～8.0內(nèi)，牛乳 LF變性是不可逆的，并且變性溫度隨著pH減小而降低，同時(shí)指出由于pH 2.0條件下LF具有最大的疏水性，使其在(25±1)℃時(shí)發(fā)生變性，并且此時(shí)變性溫度并不容易準(zhǔn)確測定，所以認(rèn)為牛乳LF的變性溫度在 pH 3.0 下降到最低［8］。

基于不同加熱強(qiáng)度LF活性的變化，Paulsson等發(fā)現(xiàn)，巴氏殺菌(72℃、15 s)對(duì)apo-LF和holo-LF的抗菌活性沒影響，但UHT(135℃、4 s)處理后holo-LF不能結(jié)合到細(xì)菌上，并且apo-LF也失去抑菌活性［9］。Oria等研究發(fā)現(xiàn)，137℃、8 s處理后LF對(duì)單核細(xì)胞的增殖作用幾乎沒影響［10］。Dupont等檢測發(fā)現(xiàn)，與原料乳相比較，巴氏殺菌對(duì)乳中LF并無顯著影響，經(jīng)過120～139℃、4 s處理后，LF的活性基本完全喪失，變性率為 95.38%［11］。

1.3 熱處理誘導(dǎo)乳鐵蛋白的結(jié)構(gòu)表征

Sanchez等對(duì)牛乳LF在72℃到85℃變性一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)發(fā)現(xiàn)，apo-LF比holo-LF更易變性，分析原因可能是因?yàn)殍F離子的結(jié)合促使LF二硫化物結(jié)合，從而防止了蛋白聚合［12］。Indyk等采用免疫分析方法，通過多表位決定因素分析加熱后蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致完整構(gòu)象損失，發(fā)現(xiàn)將原料乳和水溶液中的LF(pH 6.8)經(jīng)過70℃、2 min的熱處理后，85%的 LF保持完整的抗原特性，證實(shí)典型的巴氏殺菌所造成的LF的熱暴露，能夠保留構(gòu)象的完整性，較高溫度和時(shí)間的加熱強(qiáng)度使LF的完整構(gòu)象發(fā)生顯著損失，研究中通過熱誘導(dǎo)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)確定牛乳LF變性的第一階段為蛋白質(zhì)構(gòu)象的展開，同時(shí)LF的變性受到鐵結(jié)合狀態(tài)的影響，而且apo-LF和holo-LF構(gòu)象的展開是相互獨(dú)立的，提出蛋白質(zhì)發(fā)生部分的變性會(huì)導(dǎo)致其構(gòu)象受到干擾，結(jié)果是仍保留其活性功能或者導(dǎo)致聚集、沉淀和功能喪失［13］。

Guillaume等描述了LF的熱聚合機(jī)制，如圖1所示，提出在早期階段，加熱后LF形成非共價(jià)鍵結(jié)合的可溶性低聚體，然后這些低聚物通過二硫鍵或者非共價(jià)鍵的分子間聚集形成較大的不溶性聚合物。聚合物形成的程度取決于LF的鐵飽和度，apo-LF對(duì)熱較敏感，接近60℃加熱時(shí)開始發(fā)生變性，暴露非共價(jià)鍵的位點(diǎn)，通過非共價(jià)鍵和二硫鍵反應(yīng)并形成非共價(jià)鍵聚合體。Holo-LF中結(jié)合的鐵可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，當(dāng)溫度達(dá)到80℃時(shí)二硫鍵發(fā)生反應(yīng)，通過分子間二硫鍵交聯(lián)形成可溶性的聚合體［14］。

圖1 缺鐵型乳鐵蛋白(A)和鐵飽和乳鐵蛋白(B)的熱聚合機(jī)制Fig.1 General mechanism proposed for the thermal aggregation of native apo-lactoferrin(apo-Lf)(A)and holo-Lf(B)

2 乳過氧化物酶體系生物活性的熱穩(wěn)定性

乳過氧化物酶體系(lactoperoxidase systems，LPS)是一種牛乳中天然的抑菌系統(tǒng)，含有乳過氧化物酶(Lactopcroxidase，LPO)，硫氰酸根(SCN-)和H2O2。在H2O2存在的條件下，LPO催化SCN-，使其氧化成亞硫氰酸(HOSCN)，HOSCN會(huì)分離，中間產(chǎn)物OSCN-的主要抗菌機(jī)制是氧化包括酶在內(nèi)的蛋白質(zhì)分子巰基(SH)，使之成為硫(氧)基衍生物，并進(jìn)一步水解產(chǎn)生次磺酸。

LPO在牛乳酶系中熱穩(wěn)定性最大，LPO活力的殘留可以用來檢驗(yàn)牛乳巴氏殺菌的效果。Korhonen報(bào)道，LPO在低溫巴氏殺菌(63℃、30 min或72℃、15 s)后仍有活力，但是經(jīng) 80 ℃、2.5 s處理后失活［15］。另外，De Wit等報(bào)道 LPO完全失活需要78℃、15 s［16］。Marks等發(fā)現(xiàn)常規(guī)巴氏殺菌不能使牛乳中LPO失活，72℃、15 s巴氏殺菌后，接種銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、嗜熱鏈球菌，激活LPS后可以增強(qiáng)原料乳的保存性，但是激活的LPS在80℃、15 s處理后對(duì)以上微生物無作用或只有些少許作用［17］。Wendie等綜述報(bào)道經(jīng)過72℃、15 s巴氏殺菌，LPO的活性為加熱前的70%，在這種加熱條件下，LPO仍保持其全部的生物活性，經(jīng)過UHT處理后LPO沒有活性［18］。純化分離的LPO經(jīng)70℃、15 min殺菌后，LPO依然是穩(wěn)定的，而78 ℃、15 s時(shí)完全失活［19］。

Tayefi-Nasrabadi等研究得出，牛乳中LPO的活性在 67、69、71、73 ℃ 的 D 值分別為 116.27、31.05、9.78、6.77 min;牛乳中 LPO 的 Z 值為 4.7 ℃［20］。Lorenzena等指出牛乳中LPO的活性經(jīng)過75℃、28 s加熱后為原料乳的50% ～60%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)原料乳的LPO 活性為(2 940 ±40)U/L，經(jīng)過 35、45、55、65、75、85℃加熱90 s后，活性分別為(2 550±50)、(2425±25)、(2375 ±75)、(1913 ±38)、(338 ±19)、＜5U/L［21］。Dumitrascu 等得出牛乳中 LPO 在 70、71、72、73、75、77 ℃的 D 值分別為(89.52 ±10.69)、(42.88±3.38)、(22.97 ± 0.70)、(13.59 ± 1.02)、(3.58 ±0.14)、(0.77 ± 0.14)min，Z 值為(3.58 ± 0.004)℃［22］。LPO鈍化溫度的差異主要是由于牛乳樣品中脂肪含量的差異引起［23］，也可能是由于體系中酸度不同引起，原因是LPO在酸性條件下熱穩(wěn)定性下降［24］。有研究認(rèn)為LPO的熱穩(wěn)定性與其結(jié)構(gòu)高度有序相關(guān)，LPO中含有8個(gè)二硫鍵和鈣離子［25］，然而這一假設(shè)需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 熱處理對(duì)免疫球蛋白生物活性的影響

3.1 免疫球蛋白的熱穩(wěn)定性

免疫球蛋白是牛初乳和常乳里最重要的免疫活性蛋白，牛乳中的免疫球蛋白主要有IgA(Immunoglobulin，IgA)，IgG(Immunoglobulin，IgG)，IgM(Immunoglobulin，IgM)。免疫球蛋白相對(duì)于其他乳清蛋白更易變性，因而免疫球蛋白熱穩(wěn)定性的相關(guān)研究較多。

Mainer等通過對(duì)比免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)經(jīng)過62～81℃熱處理后的熱變性情況，指出IgG最耐熱，IgM是最不耐熱;低溫長時(shí)殺菌(63℃、30 min)IgM將變性30%，而對(duì)IgA和IgG不會(huì)產(chǎn)生影響;高溫短時(shí)殺菌(75℃、15 s)后IgG僅變性1%，IgA變性2%，IgM 變性14%［26］。Ustunol等發(fā)現(xiàn)經(jīng)過80℃、25 min處理后IgA對(duì)乳酸乳球菌的結(jié)合能力完全失活;85℃、20 min熱處理后IgM完全失活;IgG在85℃、30 min處理后完全失活［27］。Jelena等通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出牛乳中免疫球蛋白受加熱強(qiáng)度的變化，結(jié)果見表1 所示［28］。

表1 牛乳中不同免疫球蛋白濃度隨加熱強(qiáng)度的變化Table 1 Changes in concentration of immunoglobulin in milk according to heat intensity

此外，Dominguez等曾證實(shí)IgG能夠結(jié)合抗原，從而發(fā)揮免疫作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過60～65℃、30 min的熱處理后，IgG的活性未發(fā)生顯著變化;在69、72、77、81℃加熱時(shí)，IgG 的 D 值分別為8 504、1 387、285、52 s;Z 值為 6.6 ℃，活化能為 386.83KJ/mol［29］。

3.2 不同乳體系中免疫球蛋白的熱穩(wěn)定性

Chen等提出在75～100℃加熱時(shí)，牛初乳中的IgG比乳清和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中的IgG更加穩(wěn)定，經(jīng)過75℃、5 min的熱處理后PBS緩沖液中的IgG活性降低了40%;經(jīng)過95℃、15 s的處理后活性降低100%，而乳清和牛初乳中的IgG分別殘留42%和59%。同時(shí)，該研究也發(fā)現(xiàn)添加一定濃度的果糖、麥芽糖、糖醇(山梨糖醇、麥芽糖醇)、氨基酸(半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、天門冬氨酸)可以增加IgG的熱穩(wěn)定性［30］。

Li-Chan等［31］將IgG溶解在PBS溶液、煮沸過的牛乳和超高溫滅菌乳中，加熱溫度設(shè)定為從62.7℃到80℃，發(fā)現(xiàn)IgG經(jīng)過62.7℃、30 min的處理后活性沒有變化，在72～80℃內(nèi)，PBS溶液、煮沸過的牛乳和 UHT乳中 IgG 的 Z值分別為 6.7，8.9和 8.5℃，活化能分別為 353.3、258.3、298.5 kJ/mol。商業(yè)巴氏殺菌過程不會(huì)導(dǎo)致IgG完全破壞，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在商業(yè)加工的產(chǎn)品中，IgG具有結(jié)合細(xì)菌脂多糖的特異性抗體活性，在HTST巴氏殺菌乳、復(fù)原脫脂奶粉和源自切達(dá)干酪的乳清中都表現(xiàn)出很高的IgG水平，而罐裝煉乳、UHT乳中很少或根本沒有抗體活性。

3.3 熱誘免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的變化

Calmettes等提出，IgG活性損失的原因?yàn)槠浞肿咏?jīng)過加熱后發(fā)生構(gòu)象變化，牛初乳IgG活性含量的降低可能是由于熱處理后IgG分子變形或展開而引起的［32］。相對(duì)于Fc片段，IgG的 Fab片段中的CH區(qū)域相對(duì)熱穩(wěn)定性差，容易展開，使Fab段結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，IgG失去免疫活性。免疫球蛋白的熱變性過程是一個(gè)展開又聚合的復(fù)雜過程。在低溫下，三級(jí)結(jié)構(gòu)可能發(fā)生展開，但某些展開的區(qū)域可能發(fā)生可逆。不同的熱處理?xiàng)l件對(duì)蛋白質(zhì)變性過程中肽鏈的展開及蛋白質(zhì)的凝聚反應(yīng)的強(qiáng)度不同［33-34］。Li等提出在硼酸鹽的中性緩沖液中，IgG改變二級(jí)結(jié)構(gòu)的溫度為72℃;當(dāng)牛乳IgG在82℃加熱120 s后，IgG二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)則卷曲，同時(shí)IgG的免疫活性發(fā)生降低［35］。

4 熱處理對(duì)乳中激素、生長因子和細(xì)胞活素類成分的影響

4.1 乳體系中的激素、生長因子和細(xì)胞活素類成分

乳中的激素和生長因子，有些是完整或經(jīng)過糖基化和磷酸化等修飾從血液轉(zhuǎn)入乳中的;有些是在乳腺或乳中經(jīng)蛋白水解作用形成的;也被認(rèn)為是在內(nèi)分泌器官(乳腺)內(nèi)合成并轉(zhuǎn)入乳中的。牛乳中細(xì)胞活素類物質(zhì)與乳牛的感染情況密切相關(guān)。目前，已報(bào)道乳中含有40多種激素、生長因子和細(xì)胞活素類物質(zhì)，例如白細(xì)胞介素(interleukin，IL)，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-13，IL-16;γ-干擾素;生長因子，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)，胰島素生長因子(insulin-like growth factor，IGF)，粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)，人巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)，轉(zhuǎn)化生長因子 (transforming growth factor，TGF)和趨化因子，單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)，巨噬細(xì)胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein-1，MIP-1)，受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(regulatedupon activation normal T cell expressedand secreted factor，RANTES)和嗜酸細(xì)胞活化趨化因子(eotaxin)。

4.2 激素、生長因子和細(xì)胞活素類成分的熱穩(wěn)定性

4.2.1 加熱對(duì)胰島素生長因子-I(IGF-I)活性的影響

熱處理可以激活生長因子，Pia等發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過65℃和72℃加熱15 s的牛乳中IGF-I的濃度較原料乳高，當(dāng)原料乳經(jīng)過90℃、15 s的熱處理后，IGF-I的水平發(fā)生急劇增加，而經(jīng)過135℃、15 s加熱后，IGF-I活性發(fā)生降低［36］，指出90℃加熱可以激活 IGF-I。Kang等研究發(fā)現(xiàn)，在原料乳中添加凍干的初乳乳清粉能夠增加IGF-I的水平，經(jīng)過75℃和85℃加熱15 min后，其濃度發(fā)生降低，分別為加熱前的45.0%和45.2%［37］;經(jīng)過121 ℃、15 min 的熱處理后牛乳中沒有檢測出IGF-I活性。

Zhen等從牛初乳中分離出IGF-1，樣品凍干后測定牛乳類胰島素生長因子-I(IGF-I)在2個(gè)模型系統(tǒng)(PBS緩沖液和UHT乳)中的熱變性動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，在選定的加熱溫度(65、72、80、90℃)下，IGF-I在UHT乳中的熱變性D值均高于在PBS緩沖液中的D值;在PBS緩沖液和UHT乳中的熱變性Z值分別為24.41℃和27.12℃;且牛乳IGFI的熱變性反應(yīng)級(jí)數(shù)為1.1級(jí)。同時(shí)對(duì)IGF-I在兩個(gè)系統(tǒng)中的活化能、吉布斯自由能變、焓變和熵變進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，牛乳IGF-I在UHT乳中有更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，同時(shí)IGF-I較乳清蛋白中的β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG、IgA的熱穩(wěn)定性要強(qiáng)［38］。

4.2.2 加熱對(duì)轉(zhuǎn)移生長因子 β2(TGF-β2)活性的影響

在有關(guān)TGF-β2的研究中，Rogers等發(fā)現(xiàn)，巴氏殺菌乳和干酪加工獲得的乳清中TGF-β2的含量分別為 4.3ng/mL 和 3.7ng/mL［39］;Abderrazak 等將含有TGF-β2牛乳在57～84℃加熱2 min，發(fā)現(xiàn)加熱溫度達(dá)到66℃時(shí)，在乳清蛋白中的TGF-β2含量開始降低，加熱溫度達(dá)到76℃時(shí)，檢測不出TGF-β2的存在［40］。Ollikainen 發(fā)現(xiàn)，90 ℃、15 s的熱處理可以激活轉(zhuǎn)化生長因子 TGF-β2，同時(shí)指出盡管未激活的TGF-β2存在于乳清片段中，而激活的TGF-β2卻存在于酪蛋白中［41］。

4.3 熱誘生長因子分子結(jié)構(gòu)的變化

加熱導(dǎo)致的生長因子活性變化與其分子結(jié)構(gòu)相關(guān)，分子具有很強(qiáng)的疏水性，這有利于自身聚合和與其他蛋白質(zhì)的非特異性相互作用。已有研究表明，TGF-β2在Cys-77位有1個(gè)游離的巰基［42］，游離巰基可使其與β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、酪蛋白膠粒和脂肪球膜等成分發(fā)生反應(yīng)，從而使其分布在脂肪球表面、酪蛋白膠束和牛乳乳清相中［43］。Sylvie等指出，生長因子多數(shù)與牛乳中高分子質(zhì)量的大蛋白結(jié)合，并且以潛在的形式存在，乳中的生長因子能夠耐受巴氏殺菌的加熱強(qiáng)度;二硫鍵還原劑可以鈍化一些生長因子，如TGF-β2;此外，研究也指出由于IGF-I中有3個(gè)二硫鍵，而TGF-2中含有9個(gè)二硫鍵，所以 TGF-β2耐熱性更強(qiáng)［44］。

5 熱處理對(duì)乳中溶菌酶的影響

原料乳中的溶菌酶濃度為0～2 mg/L，平均濃度為 0.60 mg/L［45］。Abd 提出，牛乳中溶菌酶的濃度為(1.67 ±0.65)μg/mL，經(jīng)過 65 ℃、30 min 的加熱處理后，溶菌酶的濃度降低為(0.71 ±0.22)μg/mL;經(jīng)過75 ℃、15 s的處理后濃度為(1.60±0.64)μg/mL;與未加熱樣品相比，經(jīng)過85℃、1 s的處理后，溶菌酶的濃度增加23.87%，提出高溫短時(shí)間殺菌可以激活溶菌酶的活性，而低溫長時(shí)殺菌會(huì)降低該酶的活性［46］。Fox等指出溶菌酶具有一定的熱穩(wěn)定性，經(jīng)過75℃、15 min和80℃、15 s的加熱后其活性為加熱前的75%［47］。此外，Jelena等研究了牛乳中溶菌酶濃度隨加熱強(qiáng)度的變化，結(jié)果如表2所示［28］。

表2 牛乳中溶菌酶濃度隨加熱強(qiáng)度的變化Table 2 Changes in concentration of lysozyme in milk according to heat intensity

6 結(jié)論

目前，有關(guān)牛乳中生物活性成分的種類及各種生物活性成分的功能方面的研究較為全面，總體上已經(jīng)明確了不同生物活性成分的具體生物功能。然而有關(guān)不同體系(牛乳體系、初乳粉、分離純化的樣品、PBS緩沖液、乳模擬體系)中各種生物活性成分的測定方法存在不同，又由于不同體系中生物活性成分的含量、濃度和活性均較低，不同研究所報(bào)告的結(jié)果不可避免的存在一定差異。同時(shí)，加熱過程中活性成分變化的分析與討論主要集中于活性的比較層面上，也有針對(duì)加熱過程中生物活性成分保護(hù)劑(集中于免疫球蛋白)的相關(guān)報(bào)道。然而，基于熱處理過程中生物活性成分變性或者活性降低的同時(shí)，生物功能變化方面的研究相對(duì)較少，研究主要集中在活性降低(熱失活)或者升高(熱激活)比例的層次上，而針對(duì)加熱導(dǎo)致的乳中活性成分的構(gòu)效關(guān)系的相關(guān)研究甚少，主要體現(xiàn)在乳鐵蛋白、免疫球蛋白、乳過氧化物酶、生長因子(IGF-1和TGF-β2)等成分在加熱過程中會(huì)通過二硫鍵或者是非共價(jià)鍵聚合進(jìn)行研究，但是缺乏對(duì)這些化學(xué)鍵及二級(jí)結(jié)構(gòu)域的變化與生物活性成分活性降低、變性與復(fù)性程度、生物功能的關(guān)聯(lián)研究，這方面有待于進(jìn)一步探討。

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