陳紅梅，謝翎

(安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽安慶，246011)

茯苓，俗稱松苓、云苓，為擔(dān)子菌綱多孔菌科茯苓屬(Poria cocos(Schw.)Wolf)，大多寄生于松科植物馬尾松或赤松根部，為傳統(tǒng)中藥，具有利水滲濕、益脾健胃、寧心安神，增強(qiáng)機(jī)體免疫等功能［1］。茯苓富含茯苓多糖、茯苓酸、三萜羧酸、月桂酸等成分［2-3］，具有很高的藥用和營養(yǎng)價(jià)值。安徽省安慶市岳西縣隸屬于大別山區(qū)，是茯苓主要栽培基地［4］，年產(chǎn)茯苓達(dá)100多萬kg。茯苓深加工產(chǎn)業(yè)帶動(dòng)了地方經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，但是，茯苓在加工過程中，較易發(fā)生褐變，從而影響了茯苓的外觀品質(zhì)。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO，E.C.1.10.3.1)是一種含銅的末端氧化還原酶，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物體內(nèi)［5］。多酚氧化酶因能作用于酚，使之轉(zhuǎn)化為醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)之間相互聚合生成褐色素，而使植物組織呈現(xiàn)褐色［6-7］，這樣，PPO成為植物體內(nèi)引起酶促褐變的重要因素之一。酶促褐變往往因會(huì)影響蔬果的感官品質(zhì)，而使蔬果的經(jīng)濟(jì)價(jià)值降低，從而引起了人們對(duì)PPO的關(guān)注。不同植物，可能因?yàn)槠淦贩N或生長環(huán)境的差異，PPO對(duì)酶促褐變的影響也不同。目前，對(duì)于馬鈴薯、蓮藕、蘋果、香蕉等蔬果中PPO的酶學(xué)特性研究較多［8-11］，而關(guān)于茯苓PPO的研究卻未見詳細(xì)報(bào)道。本研究以茯苓為原料，對(duì)茯苓PPO的部分酶學(xué)性質(zhì)包括最適pH值，最適反應(yīng)溫度和底物濃度等進(jìn)行研究，并探討抑制劑對(duì)PPO活性的影響。通過對(duì)茯苓PPO動(dòng)力學(xué)特性的研究，采取有針對(duì)性的措施以減少茯苓加工過程中酶促褐變的發(fā)生，為優(yōu)良品質(zhì)茯苓的深加工提供依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茯苓，取自安徽省安慶市岳西縣茯苓種植基地。

丙酮、NaH2PO4、Na2HPO4、鄰苯二酚、NaCl、抗壞血酸、L-半胱氨酸、檸檬酸等均為分析純。

UV-2000紫外可見分光光度計(jì)，上海尤尼柯公司;TGL-16G高速冷凍離心機(jī)，上海精密儀器有限公司;FA2004A電子天平，上海精天有限公司，數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶液的制備

將茯苓用清水洗凈，風(fēng)干，切成小塊，準(zhǔn)確稱取5 g置于組織搗碎機(jī)中，加入預(yù)冷的丙酮，打成勻漿，抽濾，濾渣經(jīng)丙酮反復(fù)抽濾，得丙酮粉。丙酮粉經(jīng)風(fēng)干后，加入pH 7.0的經(jīng)預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液，在冰浴條件下研成勻漿。勻漿液轉(zhuǎn)入離心管中，于4℃，12 000 r/min離心20 min，上清液即為茯苓PPO粗酶液，備用。

1.2.2 PPO酶活性測定

分別取0.1 mol/L鄰苯二酚溶液0.5 mL、pH 5.5的磷酸鹽緩沖液3mL置于小試管中，充分混勻后再加入0.5 mL茯苓PPO粗酶液，用分光光度計(jì)測定其在420 nm下的吸光度值A(chǔ)。以蒸餾水為對(duì)照，每隔5 s讀取1次，連續(xù)記錄2 min。每克樣品單位時(shí)間內(nèi)吸光度值增加0.001為1個(gè)酶活力單位U。最大酶活力為100%。

1.2.3 PPO最適反應(yīng)pH值

取0.1 mol/L鄰苯二酚溶液0.5 mL于小試管中，再分別加入 pH 分別為 3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9 的磷酸鹽緩沖液 3 mL，充分混勻后，加入0.5 mL茯苓PPO粗酶液，用分光光度計(jì)測定其在420 nm下的吸光度變化值。

1.2.4 PPO最適反應(yīng)溫度

取0.1 mol/L鄰苯二酚溶液0.5mL于小試管中，再加入最適pH的磷酸鹽緩沖液3 mL，充分混勻后，加入0.5 mL茯苓PPO粗酶液，分別置于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃ 水浴鍋中保溫 5 min，冷卻，用分光光度計(jì)測定其在420 nm下的吸光度變化值。

1.2.5 底物濃度對(duì)PPO酶活性的影響

分別取濃度為 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 mol/L 的鄰苯二酚溶液 0.5 mL于小試管中，再加入最適pH的磷酸鹽緩沖液3 mL，充分混勻后，加入0.5 mL茯苓PPO粗酶液，在最適溫度下保溫5 min，冷卻，用分光光度計(jì)測定其在420 nm下的吸光度變化值。

1.2.6 PPO熱穩(wěn)定性分析

取最適pH的磷酸鹽緩沖液3 mL，加入0.5 mL茯苓 PPO 粗酶液，分別在35、45、55、65、75 ℃保溫 0、4、8、12、16、20、24 min，置于冰浴中迅速冷卻，用分光光度計(jì)測定其在420 nm下的吸光度變化值。

1.2.7 抑制劑對(duì)PPO酶活性的影響

取鄰苯二酚溶液0.5 mL于小試管中，再加入最適pH的磷酸鹽緩沖液3 mL，充分混勻后，加入0.5 mL茯苓PPO粗酶液，分別加入不同質(zhì)量濃度的NaCl、抗壞血酸、L-半胱氨酸和檸檬酸溶液1 mL，依次用分光光度計(jì)測定在420 nm下的吸光度變化值。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對(duì)茯苓PPO酶活性的影響

pH值對(duì)茯苓PPO酶活性的影響如圖1所示。茯苓PPO酶活性的最適pH值為6.5，高于或低于此值，酶活力均下降。當(dāng)pH值小于6.5時(shí)，隨著pH值的增加，酶活性也隨之增強(qiáng);而當(dāng)pH值大于6.5時(shí)，酶活性又隨著pH值的升高而下降。PPO酶活性在強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性環(huán)境中，酶活性均較低，這主要是因?yàn)镻PO是一種含銅蛋白，位于PPO酶活性中心部位的輔基Cu2+，在極端酸堿性環(huán)境中容易發(fā)生解離。當(dāng)在強(qiáng)酸性環(huán)境中，Cu2+發(fā)生解離，使酶活性大大下降或失活;當(dāng)處于強(qiáng)堿性環(huán)境中時(shí)，解離下的Cu2+容易形成Cu(OH)2沉淀，從而使得酶活性顯著降低甚至失活［12］。因此，PPO在酸性或堿性環(huán)境中，酶活性受到很大抑制，在一定程度上也能減少酶促褐變的發(fā)生。

圖1 pH值對(duì)茯苓PPO酶活性的影響Fig.1 Effect of pH on PPO activity of Poria cocos

2.2 溫度對(duì)茯苓PPO酶活性的影響

溫度對(duì)茯苓PPO酶活性的影響如圖2所示。在20～35℃，隨著溫度的升高，酶活性呈增長趨勢，當(dāng)溫度達(dá)到35℃時(shí)，茯苓PPO酶活性達(dá)到最高，茯苓PPO的最適反應(yīng)溫度為35℃。此后繼續(xù)升高溫度，酶活性呈下降趨勢。當(dāng)溫度達(dá)到75℃時(shí)，酶相對(duì)活性僅有19.4%。這是因?yàn)闇囟壬?，分子碰撞加劇，酶促反?yīng)速率也隨之加快，但酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能是密切相關(guān)的。溫度稍高會(huì)引起蛋白質(zhì)空間構(gòu)象發(fā)生一定程度的改變，酶活性中心破壞，酶蛋白變性，致使其活性下降甚至引起失活。

圖2 溫度對(duì)茯苓PPO酶活性的影響Fig.2 Effect of temperature on PPO activity of Poria cocos

2.3 底物濃度對(duì)茯苓PPO酶活性的影響

底物濃度對(duì)茯苓PPO酶活性的影響如圖3所示，符合典型的米氏方程曲線。由圖3可知，當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，隨著底物濃度的增高，酶活性也隨之增高，二者呈一級(jí)反應(yīng)。這是因?yàn)榈孜餄舛容^低時(shí)，只有一部分酶與底物結(jié)合，底物濃度決定了反應(yīng)速率;當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到0.06 mol/L時(shí)，酶活力幾乎保持不變，繼續(xù)增加底物濃度，反應(yīng)也趨于穩(wěn)定狀態(tài)，二者呈零級(jí)反應(yīng)。這是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜镞_(dá)到一定濃度時(shí)，全部跟酶的活性部位結(jié)合，酶已經(jīng)達(dá)到飽和，即使再增加底物濃度，也不會(huì)使反應(yīng)速率增加。

圖3 底物濃度對(duì)茯苓PPO酶活性的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on PPO activity of Poria cocos

根據(jù)Line weaver-Burk方程，利用雙倒數(shù)作圖法，以1/［S］為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)作圖，如圖4所示，擬合得到動(dòng)力學(xué)方程。根據(jù)方程，求得茯苓PPO動(dòng)力學(xué)參數(shù)，其中米氏常數(shù)Km=0.024 4 mol/L，最大反應(yīng)速率Vmax=121.95 U/min。

圖4 茯苓PPO酶促反應(yīng)雙倒數(shù)曲線Fig.4 Double reciprocal plot of enzyme-catalyzed reaction of PPO from Poria cocos

2.4 茯苓PPO熱穩(wěn)定性

將茯苓PPO酶置于不同溫度下分別處理一段時(shí)間，測定其酶活，對(duì)其熱穩(wěn)定性分析，結(jié)果如圖5所示。茯苓PPO酶在35℃時(shí)，酶活性較為穩(wěn)定，隨著作用時(shí)間的延長，酶活性呈緩慢下降趨勢;其次為45℃。而當(dāng)繼續(xù)增高至55、65、75℃時(shí)，酶活性呈急劇下降趨勢。在75℃下作用8 min，PPO已經(jīng)大部分失活。

2.5 抑制劑對(duì)茯苓PPO酶活性的影響

圖5 茯苓PPO酶熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermal stability of PPO from Poria cocos

在酶的反應(yīng)體系中，分別加入不同質(zhì)量濃度的NaCl、抗壞血酸、L-半胱氨酸和檸檬酸溶液，這4種抑制劑對(duì)茯苓PPO酶活性的影響如圖6所示。NaCl、抗壞血酸、L-半胱氨酸和檸檬酸溶液均對(duì)茯苓PPO酶活性具有一定的抑制作用，且抑制效果與抑制劑的質(zhì)量濃度呈正比關(guān)系。在同等質(zhì)量濃度下，L-半胱氨酸對(duì)茯苓PPO酶的活性抑制程度最大，其次是抗壞血酸、檸檬酸，最后是NaCl。L-半胱氨酸質(zhì)量濃度為0.6 mmol/L時(shí)，此時(shí)茯苓PPO酶相對(duì)酶活只有7%。L-半胱氨酸抑制茯苓PPO酶的活性，可能是因?yàn)樗梢耘c醌類物質(zhì)結(jié)合生成硫氫化合物，從而抑制酶促褐變［13］。抗壞血酸對(duì)茯苓PPO酶活性也具有較強(qiáng)的抑制作用，可能是因?yàn)樗哂羞€原性，可以將PPO酶的輔基Cu2+還原，將醌類還原成酚醛結(jié)構(gòu)，抑制醌類物質(zhì)相互聚合［14-15］。檸檬酸和NaCl對(duì)PPO活性也有一定的抑制作用，但較L-半胱氨酸和抗壞血酸來說，抑制效果相對(duì)較差。

圖6 不同抑制劑對(duì)茯苓PPO酶活性的影響Fig.6 Effect of different inhibitors on PPO activity of Poria cocos

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)茯苓PPO酶學(xué)特性的研究，茯苓PPO酶的最適pH為6.5，最適溫度為35℃，最適底物濃度為0.06 mol/L。PPO酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)符合米氏方程，米氏常數(shù)Km=0.024 4 mol/L，最大反應(yīng)速率Vmax=121.95 U/min。PPO的耐熱性較差，75℃下熱處理8 min，可以使酶活性基本失活。NaCl、抗壞血酸、L-半胱氨酸和檸檬酸溶液對(duì)茯苓PPO酶活性有一定的抑制作用，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，抑制效果與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系。其中以L-半胱氨酸抑制效果最好，其次是抗壞血酸，再次是檸檬酸，最后是NaCl。

今后，在茯苓深加工過程中，可以采取一些措施避開PPO酶的最佳反應(yīng)條件。諸如可以在偏酸性或是偏堿性的環(huán)境中，低溫下進(jìn)行操作，抑制PPO活性，延緩褐變;PPO熱穩(wěn)定性較差，熱處理一定時(shí)間可以使酶活性部分或完全失活，但熱處理過程中也容易使茯苓其他的有效成分分解，影響品質(zhì)，因此不建議使用。另外，在加工過程中可以加入L-半胱氨酸、抗壞血酸等，這些物質(zhì)都可以抑制PPO的活性，從而減少酶促褐變的發(fā)生。在植物加工過程中，這些物質(zhì)常作為護(hù)色劑加入防止褐變的發(fā)生［16-17］，均取得了一定的效果。對(duì)于抑制劑，有研究表明具有協(xié)同作用，同時(shí)將幾種抑制劑結(jié)合使用與只加入其中一種相比較，可能對(duì)酶促褐變起到更好的抑制作用，但是，對(duì)于茯苓是否不能同樣如此，本文并沒有作進(jìn)一步研究。

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