張小麗，蔣予箭，李鋒

1(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州，310018)

2(至味食品有限公司，浙江紹興，312050)

醬油是以黃豆(或豆粕)、小麥(或面粉、麩皮)為主要原料經(jīng)微生物發(fā)酵釀制而成的一種調(diào)味品［1］。醬油富含氨基酸、糖分等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如果生產(chǎn)過(guò)程中原料、容器或管道滅菌不徹底，灌裝及儲(chǔ)存過(guò)程中管理不善，容易使產(chǎn)品感染雜菌，導(dǎo)致醬油脹袋，特別是在春夏季環(huán)境氣溫高、濕度大時(shí)容易發(fā)生［2］。醬油脹袋不僅給生產(chǎn)企業(yè)帶來(lái)直接的經(jīng)濟(jì)損失，也嚴(yán)重影響到企業(yè)的信譽(yù)［3］。

未滅菌的醬油中含有多種微生物，細(xì)菌有芽孢桿菌、片球菌、乳酸菌等，其中芽孢桿菌的含量占首位［4］;酵母菌有耐高滲酵母菌、產(chǎn)膜酵母等;霉菌有黃曲霉、米曲霉等。對(duì)醬油進(jìn)行巴氏殺菌很難將那些耐性很強(qiáng)的微生物殺死，很容易殘留些產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的微生物而導(dǎo)致醬油脹袋。若能明確找到并鑒定出導(dǎo)致醬油脹袋的微生物，進(jìn)而了解微生物的特性，可以在很大程度上幫助企業(yè)解決醬油脹袋問(wèn)題。很多文獻(xiàn)中顯示，導(dǎo)致醬油脹袋的微生物是酵母菌，也有文獻(xiàn)指出是乳酸菌和芽孢桿菌［5-6］，可見(jiàn)導(dǎo)致醬油脹袋的微生物不盡相同。本文利用細(xì)菌和真菌培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)自浙江紹興地區(qū)的脹袋醬油進(jìn)行微生物分離，通過(guò)產(chǎn)氣驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)找到導(dǎo)致醬油脹袋的微生物，然后再對(duì)該微生物進(jìn)行鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

浙江紹興某廠提供的脹袋醬油、正常醬油、未調(diào)配醬油(原油)。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

蛋白胨 10.0 g，牛肉浸膏 5.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水 1 L，pH7.2 ～7.4，121℃滅菌 20 min。用于分離和保存細(xì)菌。

1.2.2 MRS 培養(yǎng)基［7］

蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏10.0 g，酵母浸膏5.0 g，葡萄糖 20.0 g，吐溫 80 1.0 g，K2HPO42.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Mn-SO4·4H2O 0.05 g，CaCO310.0g，蒸餾水 1 L，pH 6.0～6.5。用于分離和保存乳酸菌。

1.2.3 高糖培養(yǎng)基［3］

酵母粉 10.0 g，葡萄糖500～600.0 g，NaCl 5.0 g，氯霉素 0.1 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 L，121 ℃滅菌20 min。用于分離酵母菌。

1.2.4 馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基

每升蒸餾水中含馬鈴薯(去皮切塊)300.0 g，葡萄糖20.0 g，氯霉素0.1 g，瓊脂20.0 g，將馬鈴薯去皮切塊，加1 000 mL蒸餾水，水煮10～20 min，用紗布過(guò)濾，補(bǔ)加蒸餾水至1 000 mL，121℃滅菌15～20 min。用于分離霉菌和保存霉菌、酵母菌。

1.2.5 產(chǎn)氣驗(yàn)證培養(yǎng)基

醬油原油50 mL，蒸餾水50 mL，pH 5.5，加入杜氏管，115℃滅菌20 min。

1.3 主要儀器和設(shè)備

AR-2140電子分析天平，奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Nikon E100生物顯微鏡，上海澤途機(jī)電設(shè)備有限公司;YXQ-LS-SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;pHS-3C型酸度計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)和GZX-9070MBE型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.4.1 微生物的分離與純化

根據(jù)文獻(xiàn)，脹袋醬油中的菌落總數(shù) ＜102CFU/mL［5］，在分離微生物時(shí)只需要做到 10-1稀釋度。無(wú)菌條件下，將脹袋醬油樣品充分混勻后，吸取10 mL于90 mL無(wú)菌生理鹽水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖5 min制成菌懸液，稀釋成100、10-1兩個(gè)濃度梯度。在無(wú)菌條件下準(zhǔn)確吸取不同濃度的菌液0.1 mL，分別加入裝有不同培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，用無(wú)菌玻璃棒在培養(yǎng)基表面輕輕涂布均勻［8］。每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，并做空白對(duì)照。MRS培養(yǎng)基用無(wú)菌封口膜封培養(yǎng)皿，以制造無(wú)菌環(huán)境。細(xì)菌在37℃培養(yǎng)24 h;酵母菌在28℃培養(yǎng)3～4 d;霉菌在28℃培養(yǎng)5～7 d。

觀察結(jié)果，將菌落形態(tài)不同的菌種分離，各自傳代培養(yǎng)，至少進(jìn)行3次傳代分離，得到純化菌種，標(biāo)上記號(hào)，斜面保存菌種備用［9］。

1.4.2 產(chǎn)氣微生物的驗(yàn)證

將已編號(hào)微生物接種到分離用培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)基中，按相應(yīng)條件培養(yǎng)1～2 d制備菌懸液;在無(wú)菌條件下用移液槍吸取一定量的菌懸液，加到滅菌后的產(chǎn)氣驗(yàn)證培養(yǎng)基的試管中，使溶液中菌濃度為106～107CFU/mL;每種菌3個(gè)平行，用接入無(wú)菌生理鹽水做空白對(duì)照［10］。細(xì)菌37℃，霉菌和酵母菌28℃恒溫培養(yǎng)7～14 d，觀察小導(dǎo)管中是否有氣泡;若有氣泡則為產(chǎn)氣微生物。同時(shí)，用脹袋醬油作為對(duì)照，來(lái)檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，無(wú)菌條件下吸取1 mL醬油加到裝有小導(dǎo)管的5 mL產(chǎn)氣培養(yǎng)基試管中，37℃恒溫培養(yǎng)7～14 d觀察結(jié)果。

1.4.3 產(chǎn)氣微生物的鑒定

細(xì)菌通過(guò)觀察菌落特征、菌體形態(tài)與大小以及革蘭氏染色、芽孢染色、運(yùn)動(dòng)特性等，并做對(duì)溫度、pH、NaCl的耐受性、丙二酸鹽利用等生理特性實(shí)驗(yàn)以及需氧性、明膠液化、淀粉水解、V-P、糖發(fā)酵等生化特性實(shí)驗(yàn)［8，11-13］。酵母菌則通過(guò)觀察菌落特征，染色實(shí)驗(yàn)，生理生化實(shí)驗(yàn)確定其種屬;霉菌主要進(jìn)行菌落形態(tài)和菌體特征觀察［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物的分離、純化、產(chǎn)氣驗(yàn)證結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有分離出酵母菌和霉菌及乳酸菌，但利用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分離出了細(xì)菌，根據(jù)分離結(jié)果，選擇醬油稀釋梯度為10-1的培養(yǎng)皿來(lái)分離、純化細(xì)菌，用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分離細(xì)菌的結(jié)果見(jiàn)圖1。根據(jù)細(xì)菌的菌落形態(tài)以及用顯微鏡觀察的菌體形態(tài)的不同，共分離、純化出7 株細(xì)菌，編號(hào)為:k1、k2、k3、k4、k5、k6、k7;同時(shí)，對(duì)7株細(xì)菌進(jìn)行產(chǎn)氣驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 稀釋梯度分別為100和10-1Fig.1 Dilutions of 100and 10-1

醬油稀釋梯度為100時(shí)分離細(xì)菌，菌落數(shù)太多、又很密集、相互黏連，好多菌落的形態(tài)相似，不適合用來(lái)分離菌株。稀釋梯度為10-1時(shí)分離細(xì)菌，菌落數(shù)有36個(gè)，數(shù)目適中，且分散，適合分離菌株;其中23個(gè)菌落的形態(tài)都十分相似，通過(guò)顯微鏡觀察菌體形態(tài)也極其相似，故判斷極有可能是同一種細(xì)菌，且為醬油中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌。在10-1稀釋度下，根據(jù)細(xì)菌的菌落形態(tài)以及顯微鏡觀察菌體形態(tài)的不同，共分離、純化出 7 株細(xì)菌菌株，編號(hào) k1、k2、k3、k4、k5、k6、k7，并于4℃冰箱中用營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面保藏備用。

表1 產(chǎn)氣驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Gas production verification results

根據(jù)表1可以看出，接種脹袋醬油樣品的3支試管在7天后均產(chǎn)氣顯現(xiàn)已明顯，在14天后均有嚴(yán)重的產(chǎn)氣現(xiàn)象;空白對(duì)照試管在14天內(nèi)均未出現(xiàn)產(chǎn)氣現(xiàn)象，說(shuō)明了結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。k1、k3、k4、k5、k6、k7這6株細(xì)菌在14天內(nèi)沒(méi)有一個(gè)試管出現(xiàn)產(chǎn)氣現(xiàn)象，k2菌株的1根試管在7天后有微弱的產(chǎn)氣，在14 d后3管試管均有明顯的產(chǎn)氣;由此看出，k2菌株在醬油是產(chǎn)氣的。k2菌株產(chǎn)生的氣泡體積和脹袋醬油的相比比較小，這可能是由于k2菌株對(duì)產(chǎn)氣培養(yǎng)的環(huán)境有一個(gè)適應(yīng)階段，而已脹袋醬油微生物種類多，多種微生物間存在著各種相互作用使得適應(yīng)能力稍微強(qiáng)。但總的來(lái)說(shuō)，k2菌株是導(dǎo)致醬油脹袋的一種微生物，k2菌株在產(chǎn)氣培養(yǎng)基中的產(chǎn)氣現(xiàn)象如圖2所示。

圖2 k2菌株的產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The gas production results of k2strain

2.2 產(chǎn)氣微生物的鑒定

由以上可知，產(chǎn)氣微生物k2菌株是細(xì)菌，根據(jù)細(xì)菌傳統(tǒng)的鑒定方法來(lái)鑒定k2菌株。

2.2.1 形態(tài)觀察

觀察k2菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)上的菌落形態(tài)、個(gè)體形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、運(yùn)動(dòng)性觀察，染色結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 k2菌株的革蘭氏染色和芽孢染色Fig.3 Gram and spore staining of k2strain

2.2.2 生理特性

耐溫、耐酸堿、耐鹽特性，丙二酸利用、檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 k2菌株生理特性Table 2 Physiological properties of k2strain

2.2.3 生化特性

生化特性:過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，甲基紅實(shí)驗(yàn)，V-P實(shí)驗(yàn)，硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)，明膠液化實(shí)驗(yàn)，淀粉水解實(shí)驗(yàn)，糖、醇類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，需氧實(shí)驗(yàn)等。對(duì)于糖、醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，選用液體培養(yǎng)基并在里面加入杜氏小導(dǎo)管觀察是否產(chǎn)氣，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 k2菌株生化特性Table 3 Biochemical properties of k2strain

k2菌株的菌落直徑為1～2 mm，不規(guī)則圓形，邊緣不整齊，中間有凸起，質(zhì)地表面干燥底層濕潤(rùn)，菌落顏色為灰白色，無(wú)光澤，不透明，成菌苔。在液體培養(yǎng)基中有完整菌膜、色暗、褶皺、輕度渾濁或不渾濁。

由圖3可以看出，k2菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，有芽孢，菌體呈橢圓形，菌體長(zhǎng)度為 3～5μm，直徑 ＞0.1μm，芽孢中生，芽孢為圓形，芽孢囊不膨大;不運(yùn)動(dòng)。

由生理特性可知，k2菌株具有很強(qiáng)的生存活力。在低溫10℃和高溫45℃都有生長(zhǎng)，但是在10℃及以下長(zhǎng)勢(shì)較弱，k2菌株有很強(qiáng)的耐高溫的能力但是耐低溫能力差，可以考慮將醬油進(jìn)行冷藏。實(shí)驗(yàn)測(cè)得k2菌株在含10%鹽分的培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)已經(jīng)較弱，在14%的鹽分中已經(jīng)不能生長(zhǎng)，但醬油的含鹽量一般在16%～19%，可能醬油含有的多種成分間的相互作用使得k2菌株也能在此環(huán)境下生長(zhǎng)，所以在考慮抑菌時(shí)要考慮到醬油中的環(huán)境，才能確保抑菌效果。

糖、醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)用的是液體培養(yǎng)基里面有放置小導(dǎo)管，只有發(fā)酵葡萄糖的時(shí)候出現(xiàn)了微弱的產(chǎn)氣現(xiàn)象，其他糖、醇類均未有產(chǎn)氣現(xiàn)象。由以上形態(tài)觀察和生理、生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，k2菌株為革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，菌體橢圓，芽孢中生、圓形，發(fā)酵葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇產(chǎn)酸，V-P反應(yīng)陰性，吲哚反應(yīng)陽(yáng)性等特性;根據(jù)以上特性，參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［12-13］鑒定k2菌株為巨大芽孢桿菌。

本文所研究的醬油樣品采用低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝，將沉淀過(guò)濾后的原油進(jìn)行調(diào)配(山梨酸鉀1 g/L)，調(diào)配好后經(jīng)過(guò)超高溫瞬時(shí)滅菌(121～125℃滅菌5 s，出口溫度60℃)，滅菌后經(jīng)水平葉片式過(guò)濾機(jī)過(guò)濾后泵入成品罐澄清，經(jīng)管道將成品罐中的醬油打入灌裝間，罐裝到已經(jīng)消毒過(guò)的包裝袋內(nèi)，常溫貯存1年;春夏季一般在貨架期1個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)脹袋現(xiàn)象。酵母菌和霉菌耐熱性差一般的殺菌方法就能將其殺死，芽孢桿菌要121℃滅菌25 min才能將其殺死，因此，在此滅菌條件下，芽孢桿菌很容易殘留在醬油中，在成品罐內(nèi)貯存的過(guò)程中極有可能二次生長(zhǎng)。另外，儲(chǔ)罐、管道、灌裝間環(huán)境等衛(wèi)生條件控制不好也有可能使產(chǎn)品遭受二次污染。

也有文獻(xiàn)指出在醬油中分離出了巨大芽孢桿菌［15］，但是其并未證實(shí)該細(xì)菌能在醬油中產(chǎn)氣。巨大芽孢桿菌在環(huán)境中是十分常見(jiàn)的，雖不是致病菌，但醬油中含有多種糖、醇類物質(zhì)如葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、麥芽三糖、甘油、D-阿拉伯醇、D-甘露醇等［16］，其生化特性顯示該菌能發(fā)酵多種糖產(chǎn)酸，若是殘存在醬油產(chǎn)品中，遇到適宜的條件便生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)氣，在春末、夏季氣溫較高時(shí)就會(huì)出現(xiàn)脹袋現(xiàn)象;該菌為醬油生產(chǎn)的有害菌，必須嚴(yán)格控制。成品醬油的普通滅菌方法很難將其殺死，可以通過(guò)其他方式來(lái)輔助殺菌，有研究指出防腐劑山梨酸鉀和乳酸鏈球菌屬在酸性條件下對(duì)芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用，比山梨酸鉀更廣譜、經(jīng)濟(jì)的防腐劑尼泊金酯中的尼泊金丙酯鈉只需要0.15 g/kg添加量就能很好抑制醬油中細(xì)菌的生長(zhǎng)［17-18］，防腐劑經(jīng)高溫滅菌后會(huì)降低其效能，可以考慮滅菌后添加;另外，對(duì)于工廠的生產(chǎn)環(huán)境以及設(shè)備等進(jìn)行良好的管理，避免進(jìn)行二次污染，采用熱灌裝，出廠前的短時(shí)間的熱水浴也能有效減緩脹袋［2］。

3 結(jié)論

(1)本實(shí)驗(yàn)以產(chǎn)自浙江紹興地區(qū)的脹袋醬油為研究材料，利用高糖培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)、MRS培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基分離其中的酵母菌、細(xì)菌、乳酸菌、霉菌。結(jié)果沒(méi)有分離出酵母菌、霉菌以及乳酸菌;用營(yíng)養(yǎng)瓊脂分離、純化出編號(hào)為k1～k77株細(xì)菌。

(2)經(jīng)產(chǎn)氣驗(yàn)證試驗(yàn)證實(shí)k2菌株能在醬油中產(chǎn)氣，經(jīng)菌落特征和形態(tài)的觀察、革蘭氏染色和芽孢染色以及系統(tǒng)的生理生化實(shí)驗(yàn)，參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》鑒定k2菌株為巨大芽孢桿菌。k2菌株為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，在NaCl含量0～10%、培養(yǎng)基pH4.5～9.5及培養(yǎng)溫度10～45℃均能生長(zhǎng)，并能發(fā)酵葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖等多種糖產(chǎn)酸。

［1］ 吳婷，宋江，王遠(yuǎn)亮.中國(guó)醬油釀造工藝［J］.中國(guó)調(diào)味品，2012(6):1-3.

［2］ 王瑞芝.淺述醬油產(chǎn)氣與防范［J］.中國(guó)釀造，2005(5):1-4.

［3］ 歐陽(yáng)友生，謝小保，陳儀本，等.醬油脹罐原因分析及控制技術(shù)研究［C］.上海:第十屆中國(guó)國(guó)際食品添加劑和配料展覽會(huì)學(xué)術(shù)論文集，2006:293-295.

［4］ Yi-Seual Kim，Min-Cheol Kim，Soo-jin Kim，et al.Analyses of bacterial communities in meju traditional fermented soybean bricks，by cultivation-based and pyrosequencing methods［J］.The Journal of Microbiology，2011，49(3):340-348.

［5］ 夏恒連.低鹽醬油的制法及防腐方法［J］.中國(guó)調(diào)味品，2003(5):8-10.

［6］ 郭天文，葉紅.解決醬油貨架期漲袋，爆瓶的探討［J］.中國(guó)釀造，2010(3):138.

［7］ CHEN Y，WU H，LO H，et al.Isolation and characterisation of lactic acid bacteria from jiang-gua(fermented cucumbers)，a traditional fermented food in Taiwan［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2012，92(10):2 069-2 075.

［8］ 劉蔥.現(xiàn)代食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2006.

［9］ 章銀珠.陳化傳統(tǒng)黃酒腐敗微生物的分離鑒定和特性研究［D］.無(wú)錫:江南大學(xué)碩士論文，2008.

［10］ 許喜林，黃愷婷，魏萍.腐乳中產(chǎn)氣芽孢桿菌的分離與控制研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2011，27(6):615-617.

［11］ 張紀(jì)忠.微生物分類學(xué)［M］.上海:復(fù)旦大學(xué)出版社，1990.

［12］ 東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，2002.

［13］ Buhanan R E，Gibbons N E.Bergey's Manual of Determinative Bactertology［M］.version 8中國(guó)科學(xué)院微生物研究所伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)翻譯組，譯.北京:科學(xué)出版社，1984.

［14］ 魏景超.真菌鑒定手冊(cè)［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

［15］ 李文茹，謝小保，施慶珊，等.醬油中微生物及防腐體系的效能研究［J］.中國(guó)調(diào)味品，2009(9):007.

［16］ 包啟安.醬油科學(xué)與釀造技術(shù)［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2011.

［17］ 蔣予箭，陳敏，趙賢，等.尼泊金酯鈉在醬油生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.中國(guó)調(diào)味品，2006(6):42-45.

［18］ 李海娜，朱希強(qiáng)，郭學(xué)平.天然防腐劑乳鏈菌肽復(fù)配應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］. 食品與藥品，2010，12(1):51.