梁飛，李亞蕾，趙江，柴超凡，吳天宇

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021）

沙蔥（Allium victorialisL.）又名蒙古韭、野蔥、山蔥，胡穆利（蒙語）等，是一種廣泛分布于我國西北及內(nèi)蒙古荒漠草原、沙地的百合科蔥屬多年生鱗莖叢生草本植物[1]。具有抗旱、抗寒、抗病性、適應(yīng)性強、易于栽培等特性，尤其適宜于荒漠綠洲邊緣的沙壤土栽培，在東北、西北、華北 2000 m以下的沙地、山坡、干河床上均可生長[2]。其嫩葉營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨特，涼拌、炒食或腌制皆可食用，并具有一定的藥理作用[3]，同時也是一種優(yōu)等的飼用植物。

食品的腐敗變質(zhì)給日常生活和工業(yè)生產(chǎn)造成很大損失，利用防腐保鮮劑可延長食品的保存期。防腐保鮮劑主要有天然的、合成的兩類，合成防腐劑有一定的毒性，往往給人類健康帶來一定的不良影響。而天然防腐劑不僅在安全上有保證，也更符合消費者的需要。近年來，我國對天然防腐劑的研究十分重視，分別對茶葉提取物、香辛料提取物、少數(shù)蔬菜提取物、細菌素等物質(zhì)的防腐效果進行了研究[4]，而對沙蔥提取物的抑菌作用的研究還鮮見有更多報道。本項目利用乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇、水溶劑，對沙蔥中抑菌物質(zhì)的提取效果進行比較，優(yōu)化提取工藝，以期為沙蔥抑菌資源的合理開發(fā)利用，提供一定的理論基礎(chǔ)和科學(xué)參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、灰霉、釀酒酵母。寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院微生物實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

細菌固體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂 15 g～20 g，水 1000 mL，pH7.0～7.2；

霉菌固體培養(yǎng)基：馬鈴薯（切碎成塊）200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15 g～20 g，水 1000 mL，pH 自然；

酵母菌固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母膏 10 g，瓊脂5 g～20 g，水 1000 mL，pH自然；

液體培養(yǎng)基：細菌、霉菌、酵母菌固體培養(yǎng)基中不添加瓊脂即可；

1.1.3 試劑

無水乙醇、生理鹽水（0.9%NaCl）、0.1 mol/L HCl、0.1 mol/LNaOH；

1.1.4 設(shè)備

AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LRH-150B生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA：上海亞榮生化儀器廠；JJ-2組織搗碎勻漿機：江蘇同華儀器廠；電熱恒溫水浴鍋：北京長源實驗設(shè)備廠；不銹鋼手提式滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；WX-2型無油真空泵：臨海市精工真空設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 沙蔥提取物的制備

1.2.1.1 沙蔥漿液的制備

將新鮮沙蔥洗凈，切段，用組織搗碎機破碎，打成勻漿后取出備用。

1.2.1.2 沙蔥水提液的制備

取沙蔥勻漿，按1∶20（g∶mL）的比例和蒸餾水混合，常溫（18℃）浸提3 h，抽濾（重復(fù)3次），合并濾液后于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮（水浴恒溫50℃，水真空），制成1 g/mL的沙蔥水浸提液。

1.2.1.3 沙蔥醇提液的制備

取沙蔥勻漿，按 1∶20（g∶mL）的比例與 70%乙醇溶液混合，常溫（18℃）浸提3 h，抽濾（重復(fù)3次），合并濾液后于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮（水浴恒溫45℃，真空），制成1 g/mL的沙蔥乙醇提取液。對采用有機溶劑提取的浸提液，為了消除乙醇對測定結(jié)果的干擾和影響，在浸提結(jié)束后，濾液在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，即能提高濃度，又能徹底揮發(fā)掉乙醇。

1.2.2 抑菌試驗[5-7]

1.2.2.1 菌種的活化

先將5種供試菌種接入相對應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上進行活化，細菌置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；霉菌及釀酒酵母置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.2.2 菌懸液的制備

取活化好的菌種，在無菌條件下，分別挑取一環(huán)菌種放入9 mL無菌生理鹽水中振蕩搖勻制成一系列菌懸液，通過平板計數(shù)法，進行菌落計數(shù)，確定菌液的稀釋度，使用含菌數(shù)108CFU/mL的菌懸液。

1.2.2.3 抗菌效力的測定

采用濾紙片法：其原理是配制固體培養(yǎng)基滅菌后倒平皿，將一定比例的菌懸液均勻涂布于平板上，將濾紙片在一定濃度的待測液中浸濕，取出晾干，隔一定距離平鋪于含菌平皿中，在適宜的溫度下培養(yǎng)一定時間后，測定抑菌圈直徑，以無待測樣的試液作為空白。抑菌圈直徑大，抗菌效力高。

具體操作為：用打孔器將定性濾紙加工成直徑為10mm的圓形濾紙片放入干燥的平皿中于121℃干熱滅菌20 min，冷卻后放入不同沙蔥浸提液中浸泡10 min，然后用在無菌操作臺上風(fēng)干。配制細菌、霉菌、酵母菌固體培養(yǎng)基，121℃濕熱滅菌30 min冷卻后倒平板。在無菌條件下，吸取0.1 mL菌懸液均勻涂布于平板上，再用無菌鑷子夾取浸有供試液的濾紙片3片，間隔一定距離貼在含菌平板上，然后將各平皿置于恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。細菌在37℃下培養(yǎng)24 h，霉菌、酵母菌28℃下培養(yǎng)48 h，取出測量抑菌圈的直徑，并記錄測量結(jié)果。

2 結(jié)果及討論分析

2.1 不同溶劑提取物對抑菌作用的影響

為了研究不同溶劑對沙蔥抑菌物質(zhì)的提取效果，選擇乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、正丁醇為溶劑，取沙蔥勻漿，按 1∶20（g∶mL）的比例與各溶劑混合，常溫（18℃）浸提3 h，抽濾（重復(fù)3次），合并濾液后于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮（水浴恒溫50℃，水真空），制成1 g/mL的沙蔥浸提液，然后進行抑菌試驗，試驗結(jié)果見表1。

表1 沙蔥不同溶劑提取物抑菌圈直徑Table 1 The antibacterial circle diameter of the different solvent extracts of Allium mongolicum regel mm

由表1可知，抑菌物質(zhì)對各供試菌株，均有抑制效果。各溶劑中以乙醇提取物，抑菌圈直徑最大，抑菌物質(zhì)提取率高，優(yōu)化試驗，以乙醇為有機溶劑。

2.2 優(yōu)化提取單因素試驗

2.2.1 溶劑體積分數(shù)對抑菌效果的影響

在提取溫度 50℃，料液比 1∶20（g∶mL）和提取時間3h的提取條件下，研究30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%對各供試菌的抑菌效果，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇體積分數(shù)對沙蔥提取物抑菌活性的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the antibacterial activity of the extracts of Allium mongolicum Regel

由圖1可知，乙醇體積分數(shù)為80%時，抑菌圈直徑最大，抑菌物質(zhì)提取率高。

2.2.2 提取溫度對抑菌效果的影響

以最適乙醇體積分數(shù)，料液比1∶20，靜置提取3 h，研究 20、30、40、50、60、70、℃下，抑菌物質(zhì)的最佳提取溫度，結(jié)果見圖2。

圖2 提取溫度對沙蔥提取物抑菌活性的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the antibacterial activity of the extracts of Allium mongolicum Regel

由圖2可知，提取溫度為60℃時，抑菌圈直徑最大，抑菌物質(zhì)提取率高。

2.2.3 料液比對抑菌效果的影響

以最佳溶劑分數(shù)和提取溫度，靜置提取3 h，研究抑菌物質(zhì)的最佳提取料液比，結(jié)果如圖3。

由圖3可知，料液比為1∶20時，抑菌圈直徑最大，抑菌物質(zhì)提取率高。

2.2.4 提取時間對提取物抑菌效果的影響

圖3 料液比對沙蔥提取物抑菌活性的影響Fig.3 Effects of ratio of the material to solvent on the antibacterial activity of the extracts of Allium mongolicum regel

以最佳溶劑體積分數(shù)、料液比1∶20、提取溫度60℃下，研究抑菌物質(zhì)的最佳提取時間，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時間對沙蔥提取物抑菌活性的影響Fig.4 Effect of extraction time on the antibacterial activity of the extracts of Allium mongolicum Regel

由圖4可知，提取時間為8 h時，抑菌圈直徑最大，抑菌物質(zhì)提取率最高。

2.2.5 正交試驗

為了獲得最佳工藝條件，利用正交“均衡分散”的特點，以乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時間為主要考察因素，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計正交試驗。正交試驗因素水平見表2，試驗結(jié)果見表3。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 正交試驗結(jié)果Table 3 The results of orthogonal test

續(xù)表3 正交試驗結(jié)果Continue table 3 The results of orthogonal test

極差分析表明，影響提取物抑菌活性的主次因素順序是：A（溶劑）＞C（溫度）＞B（時間）＞D（料液比），最佳提取工藝參數(shù)為A2B2C3D1，即乙醇體積分數(shù)80%，提取時間8 h，提取溫度70℃，料液比1∶10。

3 結(jié)論

1）在相同條件下，以乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、正丁醇、水為溶劑，提取沙蔥中的抑菌成分，以乙醇溶劑的提取率最高。

2）由單因素試驗得出沙蔥抑菌成分的最佳提取工藝條件是：乙醇體積分數(shù)80%，提取溫度60℃，提取時間 8 h，料液比 1∶20。

3）由正交試驗可知，從沙蔥中提取抑菌成分的最佳工藝條件是：酒精體積分數(shù)80%，提取時間8 h，提取溫度70℃，料液比1∶10。所選試驗條件中，對提取沙蔥抑菌活性成分的影響次序為乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間＞料液比。

[1] 楊忠仁,郝麗珍,張鳳蘭,等.大漠野菜-沙蔥的研究進展及開發(fā)策略[C].中國園藝學(xué)會第七屆青年學(xué)術(shù)討論會論文集,2006：759-760

[2] 巴俊杰,張麗春,高建萍,等.沙蔥營養(yǎng)成分分析[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2002,12(4)：114-115

[3] 斯琴巴特爾,劉新民.蒙古韭的營養(yǎng)成分與民族植物學(xué)[J].中國草地,2002,24(3)：52-54

[4] 羅家剛.天然防腐劑的研究進展[J].昭通師范高等專科學(xué)校學(xué)報,2002,24(5)：44

[5] 金恩惠.茶黃素抑菌作用的研究[J].中國食品學(xué)報,2011,11(6)：108-110

[6] 蘇士彥.食品微生物檢驗手冊[M].北京：中國輕工業(yè)出版社,1998：303-365

[7] 劉銳,陳錦閑.水法提取大蒜抑菌活性物質(zhì)條件優(yōu)化[J].中國食品學(xué)報,2011,6(3)：104-107