蔡樹(shù)杏，吳笛，王德勤

（廣州白云山和記黃埔中藥有限公司現(xiàn)代中藥研究院，廣東廣州510515）

參茸玉液酒由人參、黃精、枸杞子、茯苓、巴戟天、川芎、益智仁、馬鹿茸組方配伍而成，具有提高免疫力的功效，其主要功效成分為皂苷類成分和多糖類成分。枸杞子[1]為茄科植物寧夏枸杞Lyciun bararum L.的干燥成熟果實(shí)，具有滋補(bǔ)肝腎、養(yǎng)血補(bǔ)精、明目的作用。黃精[2]為百合科植物滇黃精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、黃精 Polygonatum sibiricum Red.或多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua的干燥根莖。具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾等功效。枸杞子和黃精是參茸玉液酒中多糖成分的主要來(lái)源?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[3]證明了其多糖具有增強(qiáng)免疫、降血脂等多種生理活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

參茸玉液酒（廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，批號(hào)：20110705）；無(wú)水葡萄糖（中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所，批號(hào)：110833-200503）；苯酚（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純）；蒽酮（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20120803，分析純）；濃硫酸（廣州化學(xué)試劑廠，分析純）；十萬(wàn)分之一電子天平（Sartorius，CP225D）；水浴鍋（上海一恒科技有限公司，HWS24）；紫外分光光度計(jì)（島津，UV-2550）。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品16.90 mg，置100 mL量瓶中，加水適量溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.2 供試品溶液的制備

精密量取供試品5 mL，置燒瓶中，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)尤?0%乙醇150 mL，加熱回流1 h，趁熱濾過(guò)，殘?jiān)?0%熱乙醇洗滌3次，每次10 mL，將殘?jiān)蜑V紙置250 mL燒瓶中，加水150 mL，置沸水浴中加熱回流1 h，趁熱濾過(guò)，殘?jiān)盁坑脽崴礈?次，每次10 mL，合并濾液和洗滌液，放冷，轉(zhuǎn)移至250 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻即可。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對(duì)照品溶液 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，分別置10 mL具塞刻度試管中，各精密加水至2.0 mL，精密加入4%的苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，置80℃水浴中保溫30 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的溶劑為空白，于490 nm處測(cè)定吸光度，以對(duì)照品加入量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。

1.2.4 樣品分析

精密量取供試品溶液1 mL，置10 mL具塞刻度試管中，精密加水1 mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自“精密加入4%的苯酚溶液1 mL”起，依法測(cè)定吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含葡萄糖的重量（mg），計(jì)算，即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚濃度的選擇

分別稱取苯酚適量，加蒸餾水配制成2%、3%、4%、5%、6%的溶液，精密量取1 mL，再分別精密加入供試品溶液1 mL、水1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，置40℃水浴中保溫30 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的溶劑為空白，在400 nm～800 nm掃描，見(jiàn)圖1。并于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，見(jiàn)表1，根據(jù)吸光度確定苯酚的最佳濃度。

圖1 供試品光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of sample

表1 苯酚濃度對(duì)吸光度的影響Table 1 Impact of concentration of phenol on the absorbance

加入2%、3%、4%、5%、6%的苯酚溶液對(duì)吸收峰的影響不大，最大吸收峰為490 nm。苯酚濃度為4%時(shí)，供試品的吸光度值最大，因此，選擇加入4%的苯酚溶液進(jìn)行供試品溶液的制備。

2.2 硫酸溶液用量

分別精密量取供試品溶液4份，每份1 mL，各精密加水1 mL、4%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸 4、5、6、7 mL，搖勻，放置 10 min，置 40 ℃水浴中保溫30 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的溶劑為空白，于490 nm處測(cè)定吸光度值，見(jiàn)表2，比較吸光度值，確定硫酸用量。

表2 硫酸加入量對(duì)吸光度值的影響Table 2 Impact of volume of sulfuric acid on the absorbance

供試品溶液在加入硫酸的量為5 mL時(shí)，吸光度值最大，故選擇加入硫酸的量為5 mL。

2.3 水浴溫度的選擇

分別精密量取供試品溶液4份，每份1 mL，各精密加水1 mL、4%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸 5 mL，搖勻，放置 10 min，分別置 40、60、80、100 ℃水浴中保溫30 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的溶劑為空白，于490 nm處測(cè)定吸光度值，見(jiàn)表3，比較吸光度值，確定水浴溫度。

表3 水浴溫度對(duì)吸光度值的影響Table 3 Impact of temperature of water bath on the absorbance

結(jié)果表明，水浴溫度對(duì)吸光度值的影響不明顯，為了保證顯色反應(yīng)完全，且方便操作，選擇80℃為供試品的水浴溫度。

2.4 水浴時(shí)間

分別精密量取供試品溶液4份，每份1 mL，各精密加水1 mL、4%苯酚溶液1mL，搖勻，迅速精密加入硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，在80℃水浴中，分別保溫 15、20、30、40 min，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的溶劑為空白，于490 nm處測(cè)定吸光度值，見(jiàn)表4，比較吸光度值，確定水浴時(shí)間。

表4 水浴時(shí)間對(duì)供試品吸光度的影響Table 4 Impact of time of water bath on the absorbance

結(jié)果表明，水浴時(shí)間對(duì)吸光度值的影響不明顯，為了保證顯色反應(yīng)完全，且方便操作，選擇30 min為供試品的水浴時(shí)間。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

精密量取對(duì)照品溶液 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，分別置10 mL具塞刻度試管中，各精密加水至2.0 mL，精密加入4%的苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，置80℃水浴中保溫30 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的溶劑為空白，于490 nm處測(cè)定吸光度，見(jiàn)表5，以對(duì)照品加入量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，見(jiàn)圖2，得回歸方程y=1.096x-0. 0514，r2=0. 9993，線性范圍為0. 02535 mg/mL～0. 05915 mg/mL。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 5 Standard curve

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve

2.5.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液0.4 mL，置10 mL具塞刻度試管中，精密加水至2.0 mL，精密加入4%的苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，置80℃水浴中保溫30 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的溶劑為空白，于490 nm處連續(xù)測(cè)定吸光度值6次，見(jiàn)表6，計(jì)算RSD值為0.38%，說(shuō)明儀器精密度良好。

表6 精密度試驗(yàn)Talbe 6 Precision test

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)同一份顯色后的供試品，在490 nm處，分別放置 0、10、20、30、60、120、180 分鐘后測(cè)定吸光度值，見(jiàn)表7，計(jì)算RSD為1.13%，說(shuō)明樣品放置3 h穩(wěn)定性良好。

表7 穩(wěn)定性試驗(yàn)Talbe 7 Stability test

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取同一批樣品6份，按“供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，分別取供試品溶液1 mL，加水1 mL，再加入4%的苯酚溶液1 mL及硫酸5 mL，搖勻，立即置80℃水浴中加熱30 min，取出，置冷水浴冷卻5 min，于490 nm處測(cè)定吸光度，見(jiàn)表8，計(jì)算RSD為1.23%，說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收試驗(yàn)

分別精密量取供試品溶液0.5 mL，各加入對(duì)照品溶液 0.15、0.20、0.25 mL混勻，加水至2 mL，再加入4%的苯酚溶液1 mL及硫酸5 mL，搖勻，立即置80℃水浴中加熱30 min，取出，置冷水浴冷卻5 min，于490 nm處測(cè)定吸光度，見(jiàn)表9，計(jì)算回收率。結(jié)果證明，該方法準(zhǔn)確性良好。

表8 重復(fù)性試驗(yàn)Talbe 8 Repeatability test

表9 加樣回收試驗(yàn)Table 9 Recovery of added samples test

2.6 樣品檢測(cè)與分析

分別取不同批號(hào)的樣品6份，按“供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，分別取供試品溶液1 mL，加水1 mL，再加入4%的苯酚溶液1 mL及硫酸5 mL，搖勻，立即置80℃水浴中加熱30 min，取出，置冷水浴冷卻5 min，于490 nm處測(cè)定吸光度，見(jiàn)表10。由此可見(jiàn)，每100 mL樣品含多糖的量平均為0.388 g。

3 結(jié)論

苯酚-硫酸法測(cè)定參茸玉液酒中多糖方法穩(wěn)定，精密度高，線性范圍為0.02535mg/mL～0.05915mg/mL，相關(guān)系數(shù)為r2=0. 9993，平均回收率為100.44%。在本研究試驗(yàn)條件下，參茸玉液酒中多糖的最大吸收波長(zhǎng)為490 nm。苯酚的濃度和硫酸的加入量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響較大，原因可能是苯酚和硫酸是本實(shí)驗(yàn)的顯色劑，在定量加入苯酚的前提下，苯酚的濃度影響了顯色反應(yīng)的完全程度；而硫酸的加入量一方面影響了顯色反應(yīng)的完全程度，另一方面又影響了顯色后絡(luò)合物的濃度。本研究檢測(cè)了濃度為2%～6%的苯酚溶液對(duì)吸光度的影響，發(fā)現(xiàn)苯酚濃度為4%時(shí)，供試品的吸光度值最大，因此，選擇加入4%的苯酚溶液進(jìn)行供試品溶液的制備；本研究還檢測(cè)了硫酸的加入量為4 mL～7 mL時(shí)對(duì)吸光度的影響，發(fā)現(xiàn)供試品溶液在硫酸的加入量為5 mL時(shí)，吸光度值最大，故選擇加入硫酸的量為5 mL。本研究結(jié)果顯示，水浴溫度在40℃～100℃范圍內(nèi)，水浴時(shí)間在15 min～40 min范圍內(nèi)，水浴溫度和時(shí)間對(duì)吸光度值的影響不顯著，但是為了保證顯色反應(yīng)完全，且方便操作，我們選擇了最佳的水浴溫度為80℃，加熱時(shí)間為30 min。

表10 樣品檢測(cè)Talbe 10 Determination of samples

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010：232-233

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010：288

[3] 朱燕飛.枸杞子藥理作用概述[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志,2005,15(5)：322-323