孫玥，李暢，馮一兵，李鐵晶

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

乳鐵蛋白（Lactoferrin，Lf）作為典型的食源性抗菌蛋白，是一種鐵結(jié)合糖蛋白，主要來源于牛、人、豬等哺乳動(dòng)物的乳汁中[1]。它不僅參與生物體內(nèi)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)，促骨細(xì)胞生長、分化，而且具有抗微生物、抗病毒、抗氧化、抗癌等功能[2-3]。其中，最突出的功能是其廣譜的抗菌活性。尤其是乳鐵蛋白在胃蛋白酶水解作用下，釋放乳鐵蛋白肽（Lfcin）具有更出色的生物活性[4]。大量研究表明[5-7]，乳鐵蛋白對(duì)多種革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性細(xì)菌以及一些真菌表現(xiàn)出良好的抑制能力。人體服用很多抗菌蛋白無毒副作用[8-9]，并且其在體內(nèi)還可以被蛋白酶降解，雙重安全的保證使得抗菌蛋白在食品工業(yè)中將有著廣闊的應(yīng)用前景。

大量研究報(bào)道[10-12]均重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)乳鐵蛋白作為天然食品防腐劑“低毒高效”的優(yōu)勢，而對(duì)乳鐵蛋白是否能夠促進(jìn)微生物生長繁殖的問題，鮮有報(bào)道。食源性抗菌蛋白的分子本質(zhì)是蛋白質(zhì)，可為微生物生長N源和C源兩大營養(yǎng)要素[13]。在微生物的生長繁殖過程中，可能促進(jìn)微生物的生長。因此，本實(shí)驗(yàn)以乳鐵蛋白為對(duì)象，研究其在抑菌試驗(yàn)中，不同濃度作用下，對(duì)大腸桿菌生長抑制或促進(jìn)的情況。通過改變大腸桿菌的初始密度，觀察乳鐵蛋白抑菌效果的變化，并對(duì)比不同來源乳鐵蛋白的作用效果，增加實(shí)驗(yàn)的可信度。

1 材料與方法

1.1 材料

乳鐵蛋白（分別選用以下三個(gè)公司的樣品：荷蘭的DMV、澳大利亞的Tatua Corporate Profile、新西蘭的Westland Milk Products）；大腸桿菌：由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；UV-2401PC紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DELTA 320型pH計(jì)、電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；試劑配制與培養(yǎng)基配制使用雙蒸水。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)含量的測定

總蛋白質(zhì)的測定采用凱氏定氮法（GB/T 5009.5-2003），配制鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液參考GB/T 5009-1-2003，配制溴甲酚綠-甲基紅混合指示劑參考GB/T 5009-1-2003。計(jì)算方法如下：

實(shí)驗(yàn)中所用的乳鐵蛋白樣品，均換算為純蛋白質(zhì)后配制溶液。

1.2.2 大腸桿菌濁度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將對(duì)數(shù)期的大腸桿菌接種于葡萄糖蛋白胨（PYG）培養(yǎng)基中，接種量為2%，37℃搖床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，選擇不同培養(yǎng)時(shí)間，用分光光度計(jì)（OD625）分別測定培養(yǎng)物的濁度，同時(shí)取該濁度的菌液，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)（GB4789.2-94），得到吸光值-菌密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 不同濃度的乳鐵蛋白對(duì)大腸桿菌的抑制作用測定

抑菌性的測定采用微量稀釋法，參考美國臨床標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)推薦的抗菌性的測定方法（NCCLS）[14-15]。選用葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基，接種的大腸桿菌在37℃下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。具體方法如下，先將乳鐵蛋白配置成100 mg/mL的溶液，用孔徑為0.22 μm的醋酸纖維膜過濾除菌，再用無菌水將其調(diào)整成不同濃度，使得PYG培養(yǎng)基中加入等體積的乳鐵蛋白溶液后，得到乳鐵蛋白終濃度分別為 0、2、4、6、8、10 mg/mL 的 PYG 培養(yǎng)基。然后將培養(yǎng)17 h的新鮮大腸桿菌接種于培養(yǎng)基中接種比例為2%，混勻，分裝于無菌試管中，每支試管3 mL，置于37℃下培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，測定625 nm處的OD值。

三組樣品均采用上述方法測定抑菌性，每組樣品每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，重復(fù)3次。為保證大腸桿菌菌落總數(shù)測定值的穩(wěn)定和濁度測定的可信度，所有涉及培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)操作均置于冰桶內(nèi)，單次測定操作時(shí)間不超過15 min。

1.2.4 大腸桿菌污染程度對(duì)乳鐵蛋白抑菌性影響的測定

使用6 mg/mL的樣品1的乳鐵蛋白添加到PYG培養(yǎng)基中，接種對(duì)數(shù)期大腸桿菌菌液，接種量分別為2%、3%、4%、5%，使菌密度分別達(dá)到 1.01×107、1.51×107、2.01×107、2.52×107cfu/mL，分裝于無菌試管中，測定不同時(shí)間的濁度，方法同2.3中所述。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

本研究中所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS16.0軟件中的單因素方差分析（One-way AVONA）和Duncan′s多重比較法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同來源乳鐵蛋白樣品的蛋白質(zhì)含量

為防止不必問題，各公司樣品隨機(jī)編號(hào)為樣品1、樣品2、樣品3，測定各乳鐵蛋白樣品蛋白質(zhì)含量的結(jié)果，見表1。

表1 不同乳鐵蛋白樣品的蛋白質(zhì)含量Table 1 The protein content of different lactoferrin samples

2.2 大腸桿菌菌密度-吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.2的方法，以大腸桿菌菌液吸光值（OD625）為橫坐標(biāo)，以菌落總數(shù)（cfu/mL）為縱坐標(biāo)，繪制出吸光值-大腸桿菌菌密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 大腸桿菌菌密度-吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of bacterial density-optical density of Escherichia coli

由圖1可得曲線方程式是：y=7.37x+0.2676（R2=0. 9987）。

2.3 不同濃度的乳鐵蛋白對(duì)大腸桿菌的抑制作用

2.3.1 不同的乳鐵蛋白樣品對(duì)大腸桿菌生長的抑制或促進(jìn)作用

選擇不同濃度的乳鐵蛋白分別添加到大腸桿菌的培養(yǎng)基中，考察不同濃度的乳鐵蛋白對(duì)大腸桿菌生長的抑制或促進(jìn)作用，結(jié)果見圖2。

圖2 不同的乳鐵蛋白樣品對(duì)大腸桿菌生長的抑制作用Fig.2 Inhibition of different lactoferrin samples on the growth of Escherichia coli

由圖2可見，在相同的濃度下，不同乳鐵蛋白樣品對(duì)培養(yǎng)中的大腸桿菌作用略有差異。有人認(rèn)為Lf的抗菌活性源于乳鐵蛋白螯合游離鐵離子的特性，使得微生物失去生長所需的鐵元素而被抑制[16-17]；還有人指出Lf是通過氨基末端強(qiáng)陽離子結(jié)合區(qū)域作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，增加其通透性而達(dá)到殺菌的作用[18-19]。本實(shí)驗(yàn)中不同樣品間抑菌活性的差異，可能與各樣品的鐵飽和程度不同有關(guān)。

2.3.2 不同濃度的乳鐵蛋白對(duì)大腸桿菌生長的抑制作用

不同濃度的乳鐵蛋白對(duì)大腸桿菌生長抑制作用的結(jié)果，見圖3。

圖3 樣品1對(duì)大腸桿菌生長的抑制作用Fig.3 Growth inhibition for Escherichia coli in samples 1

培養(yǎng)0～7 h時(shí)，在對(duì)照組、2 mg/mL組、4 mg/mL組中大腸桿菌的菌密度迅速上升，最先達(dá)到穩(wěn)定期；在濃度為6、8、10 mg/mL的3個(gè)組的菌數(shù)則無明顯變化；在7 h～22 h內(nèi)，濃度為6、8、10 mg/mL 3個(gè)組的菌密度急速上升至穩(wěn)定期，并且蛋白濃度越大，上升的速率越快。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，所有實(shí)驗(yàn)組的大腸桿菌菌液密度均大于對(duì)照組，并且添加的乳鐵蛋白濃度越大，最終的菌液濁度增幅度越大，與對(duì)照組差異顯著，結(jié)果見表2。

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間下樣品1對(duì)大腸桿菌生長影響的顯著性分析Table 2 Significance analysis of Sample 1effect on growth forEscherichia coli in at times

高濃度的Lf在培養(yǎng)初期能顯著抑制大腸桿的生長，不論其抑菌機(jī)理如何，Lf的抑菌作用存在量效關(guān)系[20]，由于E.coli處于對(duì)數(shù)增長，未被抑制的E.coli最終將呈現(xiàn)自身快速增長的特性。添加Lf的試驗(yàn)組，最終菌數(shù)高于空白組，說明Lf提供了促進(jìn)E.coli生長的營養(yǎng)要素。Lf的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，可為微生物的生長提供C源和N源，可作為微生物生長的培養(yǎng)基。多數(shù)細(xì)菌，包括E.coli不能利用大分子蛋白質(zhì)，說明大分子蛋白質(zhì)Lf促進(jìn)E.coli生長的前提是分子的降解。在試驗(yàn)條件下，導(dǎo)致Lf降解的因素很可能是來自菌體裂解后釋放的酶類，而這種菌體的裂解是否由于菌體的自溶作用則需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。Lf分子被E.coli利用時(shí)已經(jīng)降解，降解的產(chǎn)物和降解的方式的深入研究，將有助于更深刻理解抗菌蛋白的作用。

2.4 大腸桿菌污染程度對(duì)乳鐵蛋白抑菌性影響

隨著初始菌數(shù)的增加，乳鐵蛋白對(duì)大腸桿菌的最長抑菌時(shí)間縮短，見圖4。

可見，食品原料的初始污染程度顯著影響抗菌蛋白的抑菌效果；由于Lf在培養(yǎng)后期能促進(jìn)細(xì)菌生長（見2.3），在食品的保藏中可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的食品安全問題。這應(yīng)是食源性抗菌蛋白類防腐劑開發(fā)利用時(shí)，需要考慮的問題。如何與其他防腐劑復(fù)合處理改善抑菌效果將是很有益的研究。

圖4 大腸桿菌污染程度對(duì)乳鐵蛋白抑菌性影響Fig.4 Effects of pollution degree of Escherichia coli in lactoferrin antibacterial activity

3 結(jié)論

Lf在較低濃度（≤4 mg/mL）下，能促進(jìn) E.coli生長，在較高濃度（≥6 mg/mL）時(shí)能表現(xiàn)出良好的抑菌作用；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，不同濃度的Lf最終都能促進(jìn)E.coli生長，同時(shí)，菌數(shù)的增幅高于空白組。

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