黃敏桃，吳尤嬌，蔡鵑，黃云峰，賴茂祥，黃庶識，劉華鋼

（1.廣西科學(xué)院生物物理實驗室，廣西南寧530007；2.廣西生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西柳州545004；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530001；4.江西省贛州衛(wèi)生學(xué)校，江西贛州341000；5.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西南寧530022；6.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西南寧530021）

苦 丁 茶 （Ilex Kudingcha C．J．Tseng）是 冬 青 科（Aquifoliaceae）冬青屬喬木植物，別名菠蘿樹、大葉茶、苦燈茶、苦登茶，主產(chǎn)于湖南、湖北、廣東、廣西、海南等省。因采摘嫩梢加工制作而成，沖泡后具有先苦后甘的愉快口感，飲后余味猶存而得名，由苦丁茶冬青葉制成的苦丁茶是民間常用中草藥和飲品，是傳統(tǒng)中成藥“甘和茶”的主要原料之一。據(jù)《廣西萬承苦丁茶》一書記載：早在元朝期間就被指定為朝廷“貢茶”，其價值由此可見一斑。葉（苦丁茶）苦、甘、涼，主要含有三萜皂苷及甾醇、茶多酚、黃酮、生物堿、氨基酸、維生素、苦味素和對人體有益的多種微量元素[1]。具有清熱解毒，祛暑，主要用于治療頭痛、齒痛、目赤、熱病煩渴、痢疾等癥[2]。近年對苦丁茶的多糖研究較多，但是對苦丁茶多糖的月份累積未見報道。本研究選取廣西1-12月份的大葉冬青苦丁茶作為樣品，采用苯酚-硫酸比色，紫外可見分光光度計測定其多糖的含量，分析苦丁茶不同生長期多糖含量的動態(tài)變化規(guī)律，為苦丁茶合理采用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 藥材、試劑與儀器

廣西苦丁茶樣品采自廣西南寧市地委大院，為冬青科冬青屬苦丁茶冬青，采回后晾干，粉碎，備用。

濃硫酸（分析純）：廉江市愛廉化試劑有限公司；苯酚（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；水為超純水。

瑞士梅特勒-托利多超越型分析天平：Mettler Toledo XS105DU；紫外分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水式真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；超聲儀：上海必能信超聲有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件的確定

2.1.1 最佳提取條件

本研究對常溫浸提、超聲提取、加熱回流3種方法進行單因素考察，結(jié)果表明加熱回流能大大的提高了多糖的浸出率。在單因素考察基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法考察了提取溫度、提取時間及液料比對多糖浸出率的影響，確定溫度為98℃、提取時間2 h、液料比為63∶1時為多糖提取最優(yōu)提取條件，進行多糖的提取。

2.1.2 測定方法

選擇苯酚-硫酸法是利用糖類在濃硫酸作用下，水解成糠醛或其衍生物與苯酚縮合產(chǎn)生有色物質(zhì)，其顏色深淺與糖的濃度成正比。

2.1.3 測定波長

配制一定濃度的葡萄糖標準溶液，以相應(yīng)試劑為空白，分別在400 nm～800 nm處掃描，結(jié)果在482 nm處有最大吸收值。

2.2 苦丁茶多糖含量的測定

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的無水葡萄糖純品20.03 mg，用水定容于100 mL容量瓶中，再精密吸取10.00 mL定容至50 mL容量瓶中，得到40.06 ug/mL葡萄糖溶液，再分別精密吸取葡萄糖溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，并用水補足至 2.0 mL，得系列對照品溶液。

2.2.2 樣品溶液的制備

精密稱取苦丁茶粉末5.000 g，置于圓底燒瓶內(nèi)，加蒸餾水至315 mL，稱重，98℃加熱回流2 h，冷卻后加蒸餾水補足重量，將濾液稀釋20倍，備用。

2.2.3 苯酚-濃硫酸比色試劑的配制

精密稱取苯酚3.0 g，置于50 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，配置成6%的苯酚溶液，硫酸為濃硫酸試劑。

2.2.4 樣品溶液的顯色與測定

取上述樣品供試品溶液2 mL置于10 mL比色管中，精密加入6%的苯酚溶液1 mL，混勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，室溫靜置30 min后測定。

2.3 試驗方法的考察

2.3.1 標準曲線的制備

將上述系列對照品溶液分別置于10 mL試管中，分別加入1 mL 6%苯酚溶液及5.0 mL濃硫酸，待各管加完后搖勻，室溫靜置30 min，482 nm測吸光度，再精密吸取2.0 mL蒸餾水，同法操作，作為空白對照。以吸光度為縱坐標（y），葡萄糖濃度為橫坐標（x），繪制標準曲線，得回歸方程為y=0. 01311x+0. 03864，R2=0. 9979，得出標準曲線（圖1）。

圖1 葡萄糖標準溶液曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.3.2 精密度試驗

精密度試驗結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗結(jié)果Table 1 Result of precision test

按2.2.4方法連續(xù)測定對照品溶液的吸光度，測得的RSD為1.05%，表明儀器的精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗

穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 2 Result of stability test

按2.2.4方法每隔5 min測一次樣品溶液的吸光度，連續(xù)測24次，測得的吸光度RSD為2.80%。結(jié)果表明，樣品溶液在2 h內(nèi)顯色穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗

重復(fù)性試驗結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 3 Result of repeatability test

按2.2.4方法制備6份7月采收的苦丁茶樣品的制成的供試品溶液，測定其多糖含量平均值為68.9 mg/g，RSD為2.75%。結(jié)果表明，試驗的重復(fù)性好。

2.3.5 加樣回收率試驗

加樣回收率試驗結(jié)果如表4。

表4 樣品回收率試驗及結(jié)果Table 4 Result of recovery test

按2.2.4方法測定5個不同濃度樣品的回收率，回收率在95%～105%之間，平均回收率為98.618%，RSD為1.96%（＜2%）。

2.4 樣品含量測定

按2.2.2項下樣品溶液的制備方法對12個月份的廣西苦丁茶樣品進行制備供試品溶液，再按樣品溶液的顯色與測定方法在波長為282 nm下進行多糖含量的測定，得到各月份不同含糖量。樣品含量測定結(jié)果見表5及圖2。

表5 不同采收期的廣西苦丁茶多糖含量（n=3）Table 5 Content of polysaccharide of Ilex kudingcha C.J.Tseng in different months from Guangxi（n=3）

圖2 不同采收期苦丁茶多糖含量變化規(guī)律（n=3）Fig.2 Curves of content polysaccharide of Ilex kudingcha C.J.Tseng in different months

3 討論

多糖又稱多聚糖（P．1ysaccharide），由單糖聚合成聚合度大于l0的極性大分子，分子量為數(shù)萬至數(shù)百萬，糖類與核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)一起合稱為生命活動所必需的四大類化合物。研究表明，苦丁茶多糖對羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基具有一定的清除作用，對H2O2誘導(dǎo)紅細胞氧化溶血反應(yīng)，對紅細胞自氧化溶血反應(yīng)都有顯著的抑制作用[3-5]。這一系列的藥理研究引起廣泛關(guān)注，多糖含量的研究具有重要的意義。目前多糖含量測定應(yīng)用方法最多的是苯酚-硫酸法[6]，但在不同的文獻報道中硫酸的加入量不同而影響多糖含量的測定結(jié)果[7]。本試驗考察了樣品液、6%苯酚及濃硫酸比例分別為2∶1∶5和2∶1∶7。結(jié)果顯示比例為2∶1∶5所測出來的含糖量比較高，與有些文獻所說的2∶1∶7結(jié)果較好有所差別[8]，原因有可能是儀器響應(yīng)值的不同以及試劑的純度有差別。苯酚-硫酸法具有操作簡單、靈敏度高、顯色穩(wěn)定等優(yōu)勢，其檢測結(jié)果可為多糖的研究開發(fā)及應(yīng)用提供參考依據(jù)。

苦丁茶原產(chǎn)于廣西大新縣，是廣西的一種道地藥材，廣西苦丁茶不同月份多糖含量分析的結(jié)果顯示，4月份含糖量達到最高，而后慢慢下降，在11月份是含量有所提升，但是也不及4月5月的含量，12月份含量最低，如果以苦丁茶多糖生物活性作為標準，4、5月份可作為苦丁茶最佳采收期。4、5月份在廣西南寧地區(qū)的氣溫回暖，雨水逐漸增多，多糖含量隨著升高，可能與植株為了滿足新芽的萌發(fā)將貯存的營養(yǎng)轉(zhuǎn)化為可溶性糖有關(guān)。此研究結(jié)果可為苦丁茶資源的有效采摘及合理應(yīng)用提供參考依據(jù)。

[1] 劉祖生.苦丁茶化學(xué)成分研究[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1992,18(5)：66-69

[2] China National Corporation of Traditional arm Herbal Medicine(中國藥材公司).Handbook of Chinese Traditional Medicine Resources(中國中藥資源志要)[M].Beijing：Science Press,1994：689

[3] 王新,何玲玲,劉彬.苦丁茶冬青葉多糖的分離純化及其對羥自由基的清除作用[J].食品科學(xué),2008,29(6)：37-39

[4] Kit Man Lau,Z.-D.He.anti-inflammatory and hepato-protective effects of Ethnopharmacology[J].Ethnopharmacol,2002,83(1/2)：63-71

[5] 吳曉鵬,王一飛,劉秋英,等.苦丁茶多糖抗氧化活性研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2008(2)：34-36

[6] 崔紅華,李超英,張大方,等.用苯酚一硫酸法測定人參多糖含量的研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,1999,6(2)：2

[7] 劉曉河,梁惠花,譚曉紅.茵陳中多糖的含量測定[J].中草藥,2003,34(6)：519

[8] 王新,陸慧寧,林少琨.苦丁茶冬青葉多糖的提取及含量測定[J].時珍國醫(yī)國藥,2006,17(10)：1977-1979