廖振宇，汪曉冬，高亦軍

（天津市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測技術(shù)研究院，天津300384）

大蒜（Allium sativum L）為百合科蔥屬植物的鱗莖，營養(yǎng)豐富，是日常生活中常用的香辛蔬菜和調(diào)味佳品，而且具有很強(qiáng)的防病治病保健功能，歷來被視為藥食兼用佳品[1]。近年來，國內(nèi)外許多研究人員從大蒜中提取出多糖成分，并逐步發(fā)現(xiàn)大蒜多糖具有抗菌消炎、抗血凝、降血脂和防止動(dòng)脈粥樣硬化的功效，同時(shí)還有抗尿糖、保護(hù)肝功能、抗腫瘤和預(yù)防衰老等作用[2-4]。然而，大蒜多糖不能被小腸黏膜細(xì)胞吸收進(jìn)入血液，而且在體內(nèi)易被酸、堿或酶破壞，導(dǎo)致大蒜多糖生物活性失活，在體內(nèi)不能起到預(yù)期的治療效果，因此，有必要采取措施改善其在人體內(nèi)的療效[5]。

脂質(zhì)體（1iposome）最早是1965年由Bangham等作為生物膜的模型提出的[6]。脂質(zhì)體技術(shù)首先應(yīng)用在藥物載體領(lǐng)域。近年來，脂質(zhì)體在食品工業(yè)中顯示出較為廣闊的應(yīng)用空間，可用于生產(chǎn)微膠囊化的酶制劑、保護(hù)維生素在加工過程的損失、用于香精香料的包裹等[7-9]。同時(shí)，采用聚乙二醇（PEG）及其脂質(zhì)衍生物修飾脂質(zhì)體的研究受到廣泛關(guān)注，并取得很大進(jìn)展。由于經(jīng)PEG修飾后的脂質(zhì)體表面親水性增加，降低了其與吞噬細(xì)胞的親和性，因而能逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的識(shí)別而減少其對(duì)脂質(zhì)體的捕獲，延長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間[10]。因此，為提高大蒜多糖的生物利用率，穩(wěn)定性和療效，將其制備成長循環(huán)納米脂質(zhì)體材料。本實(shí)驗(yàn)以PEG2000作為修飾脂質(zhì)體膜材，采用薄膜分散法制備大蒜多糖長循環(huán)脂質(zhì)體，并對(duì)其在體外穩(wěn)定性進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜多糖：天津科技大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；卵磷脂（大豆）：上海伯奧生物科技有限公司；膽固醇、Triton X-100：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；聚乙二醇（MW：2000）：天津市天正化學(xué)試劑廠；標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL）和蒽酮（質(zhì)量濃度為2 mg/mL）：均為天津市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測技術(shù)研究院食品檢驗(yàn)室自配得到。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；BI-90Plus激光粒度儀/Zeta電位儀：美國布魯克-海文公司；JEOL-100CXII型透射電子顯微鏡：日本電子光學(xué)公司；UV-9100型紫外可見光分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器廠；萬分之一天平BS110：北京賽多利天平有限公司；PHB-4型pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大蒜多糖脂質(zhì)體溶液制備

采用薄膜分散法[11]制備大蒜多糖脂質(zhì)體的過程如下：精確稱取適量大豆卵磷脂和膽固醇（質(zhì)量比例為2∶1），加入到50 mL茄形瓶中，溶于一定量的乙醚中，然后在35℃下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上以50 r/min的旋轉(zhuǎn)速度進(jìn)行旋蒸，同時(shí)向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中通入適當(dāng)流速的氮?dú)饬骷右员Ｗo(hù)。當(dāng)茄形瓶中形成一層透明均勻的脂質(zhì)膜后，繼續(xù)旋蒸30 min，之后將茄形瓶取下，向茄形瓶中加入含PEG2000和大蒜多糖的磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.2）適量，將脂質(zhì)膜水化，然后用超聲波清洗器以60 W的功率進(jìn)行超聲分散，直至形成半透明乳液，通過內(nèi)徑0.8 μm微孔濾膜后，即得大蒜多糖脂質(zhì)體。

1.3.2 大蒜多糖脂質(zhì)體形態(tài)學(xué)觀察

將上述脂質(zhì)體混懸液用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察，透射電子顯微鏡采用磷鎢酸負(fù)染法進(jìn)行，用微量取樣器將大蒜多糖脂質(zhì)體溶液滴加到銅網(wǎng)上，靜置過夜后透射電鏡下觀察其微觀形貌。

1.3.3 粒徑和粒度分布研究

取上述脂質(zhì)體混懸液樣品適當(dāng)稀釋進(jìn)行超聲分散，然后將液體樣品加入專用的測試皿中，用BI-90Plus激光粒度儀/Zeta電位儀測試分析樣品的粒徑。

1.3.4 大蒜多糖含量分析

采用蒽酮-硫酸法測定大蒜多糖含量，原理為多糖在濃硫酸的作用下可脫水生成糖醛衍生物，后者再與蒽酮作用形成藍(lán)色化合物，與同法處理的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液比色定量。具體如下：分別吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液 0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0 mL，置于具塞比色管中，用蒸餾水稀釋至1.0 mL，搖勻。然后分別加入蒽酮試劑4.0 mL，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加蓋，以防蒸發(fā)。自水浴沸騰起計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確煮沸10 min，取出，用冰浴冷卻至室溫，于波長620 nm測吸光度，以1.0 mL水按同樣操作作為空白，以葡萄糖濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，制得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品液的制備：分別配成濃度為10 mg/mL的大蒜多糖。

測定：吸取1 mL已稀釋的大蒜多糖于試管中，加入4.0 mL蒽酮試劑，平行3份；空白管以等量蒸餾水替代大蒜多糖。以下操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。根據(jù)平均值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出葡萄糖的含量（μg），由此可得到多糖的含量。

1.3.5 脂質(zhì)體包封率的測定方法

取10 mL大蒜多糖脂質(zhì)體在 7000 r/min離心20 min，把上層清液去掉，用磷酸鹽緩沖液定容至10 mL，再以 7000 r/min離心20 min，去掉上層清液，加Triton X- 1005%乙醇溶液2 mL破乳，用上述方法測定脂質(zhì)體內(nèi)包裹大蒜多糖的含量。

脂質(zhì)體包封率計(jì)算公式為：

1.3.6 大蒜多糖脂質(zhì)體穩(wěn)定性初步研究

觀察大蒜多糖脂質(zhì)體混懸液在不同溫度、不同儲(chǔ)存時(shí)間等條件下對(duì)其泄漏率和粒度的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜多糖脂質(zhì)體形態(tài)學(xué)觀察

在透射電鏡下觀察，大蒜多糖長循環(huán)脂質(zhì)體分布均勻、顆粒間彼此分散較好、獨(dú)立、連續(xù)呈圓形或橢圓形微球體（見圖1）。

2.2 粒徑和粒度分布的檢測結(jié)果

大蒜多糖脂質(zhì)體的平均粒徑為115.4 nm，粒徑分布見圖2。

脂質(zhì)體的粒徑較小，多分散指數(shù)為0.308，說明其分布均勻。

2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

本實(shí)驗(yàn)采用蒽酮-硫酸法測定大蒜多糖含量，見圖3。

圖2 大蒜多糖脂質(zhì)體粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution of garlic polysaccharide liposomes

圖3 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of glucose

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，以吸收度A620對(duì)葡萄糖濃度作回歸曲線得：Y=0.037x+0. 0039，r=0． 9991，表明葡萄糖在2 μg/mL～20 μg/mL的濃度范圍之間與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.4 包封率的測定

本實(shí)驗(yàn)用Triton X- 1005%乙醇溶液破壞脂質(zhì)體雙層膜，測定長循環(huán)脂質(zhì)體中被包封的大蒜多糖含量，計(jì)算脂質(zhì)體的包封率。通過計(jì)算分析，大蒜多糖長循環(huán)脂質(zhì)體的平均包封率為71.94%，普通脂質(zhì)體的包封率為59.23%，說明經(jīng)PEG包覆的脂質(zhì)體的包封率明顯高于無PEG修飾的普通大蒜多糖脂質(zhì)體，這可能由于PEG具有一定的柔性，可交錯(cuò)重疊覆蓋在脂質(zhì)體的表面，形成致密的構(gòu)像云，從而起到穩(wěn)定脂質(zhì)體的作用。

2.5 大蒜多糖長循環(huán)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性考察

大蒜多糖長循環(huán)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性考察指標(biāo)有很多，本文選擇外觀、粒徑、泄漏率指標(biāo)來考察其穩(wěn)定性，基本上能反映脂質(zhì)體的穩(wěn)定性變化結(jié)果見圖4、圖5。

圖4 保存時(shí)間和溫度對(duì)大蒜多糖長循環(huán)脂質(zhì)體泄漏率的影響Fig.4 Effects of storage time and temperature on the leakage rate of liposomes

圖5 保存時(shí)間和溫度對(duì)大蒜多糖長循環(huán)脂質(zhì)體粒徑的影響Fig.5 Effects of storage time and temperature on the particle size distribution of liposomes

由圖4可知，脂質(zhì)體的泄漏率隨保存時(shí)間的延長逐漸增大；隨著溫度的升高，泄漏率都隨之增加。從圖5可知，脂質(zhì)體的粒徑隨保存時(shí)間的延長逐漸增大；隨著溫度的升高，粒徑也隨之增加，但泄漏率和粒徑在調(diào)查的時(shí)間和溫度范圍內(nèi)沒有大幅度增加，均在可接受的合理范圍內(nèi)，說明大蒜多糖長循環(huán)脂質(zhì)體具有較好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

國內(nèi)外有不少有關(guān)大蒜多糖的提取純化工藝和生物活性等方面的研究報(bào)道。但很少有報(bào)道將大蒜多糖制備成脂質(zhì)體以改善其生物利用率和療效。常用制備脂質(zhì)體的方法有逆相蒸發(fā)法、超聲波分散法、冷凍干燥法、薄膜分散法、膜擠壓法、注入法等。本實(shí)驗(yàn)選擇薄膜分散法制備脂質(zhì)體，是基于該方法操作簡單、條件溫和、適合于生物大分子脂質(zhì)體的制備。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)聚乙二醇（PEG）修飾的長循環(huán)脂質(zhì)體形態(tài)圓整、分散均勻，平均粒徑為115.4 nm，對(duì)大蒜多糖的包封率為71.94%，明顯高于普通脂質(zhì)體的包封率，說明PEG包覆脂質(zhì)體有利于提高包封率，更好地控制藥物釋放和靶向性，延長在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)制備的納米脂質(zhì)體在設(shè)計(jì)的保存時(shí)間和溫度范圍下具有較好的穩(wěn)定性，對(duì)脂質(zhì)體的滲漏率和粒徑變化的影響均在可接受的范圍內(nèi)。

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