張靜，趙欣

（1.重慶市腫瘤醫(yī)院婦瘤科，重慶400030；2.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶400067）

蟲茶是一種主產(chǎn)于我國的不屬于普通茶葉的范疇，但卻以保健茶或藥用茶的形式出現(xiàn)的以昆蟲食葉后排泄的蟲糞粒泡制的奇特茶飲料[1]。生產(chǎn)蟲茶的昆蟲已知有夜蛾科弓須亥夜蛾Hydrillodes morosa Butler.（化香夜蛾、黃紋淡黑夜蛾）與雪疽夜蛾Nodaria niphona Butler.；螟蛾科米縞螟Aglossa dimidiata Haworth.（米黑蟲），黃條谷螟Herculia glaucinalis L.（谷粗喙螟），白條谷螟Fujimacia bicoloralis Leech.，均是以幼蟲取食苦藤茶、苦丁茶、化香樹、大百解、三葉海棠等植物的葉片后，排泄的蟲糞，收集加工即成為蟲茶產(chǎn)品[2]。其中貴州產(chǎn)蟲茶除了遍銷全國還遠(yuǎn)銷東南亞，貴州產(chǎn)蟲茶主要是米縞螟弓須亥夜蛾等昆蟲幼蟲啃食樟科潤楠屬的川黔潤楠（Machilus chuanchienensis S.Lee.）腐熟幼嫩葉片后經(jīng)由昆蟲體內(nèi)特殊代謝排出糞粒曬干制成[3]。

蟲茶作為傳統(tǒng)飲品和中藥，具有清熱、去暑、解毒、健胃、助消化等功效，對(duì)腹瀉、鼻衄、牙齦出血和痔出血均有較好療效，是一種很好的醫(yī)藥保健飲料[4]。蟲茶中含有 K、Mg、Ca、Na、Fe、Mn、Zn 等共 17 種礦物質(zhì)元素，其中約有10種元素為人體必需微量元素，且Fe、Zn、Ca、Mg等元素含量較高，優(yōu)于一些名優(yōu)茶[5]。此外，不同蟲茶中還富含有粗蛋白、粗纖維、脂肪、茶多酚、咖啡堿、糖分、維生素和氨基酸[6-7]。近年關(guān)于茶葉在抗癌方面的研究已經(jīng)全免展開，其中類茶類茶飲料的抗癌研究也獲得了初步結(jié)果。關(guān)于蟲茶的抗癌效果還沒有開展，為了驗(yàn)證蟲茶的體外抗乳腺癌效果，本研究初步對(duì)貴州出產(chǎn)蟲茶進(jìn)行了MCF-7人乳腺癌細(xì)胞體外抗癌功能性的研究。

1 材料與方法

1.1 樣品

蟲茶：市售原產(chǎn)貴州蟲茶，進(jìn)行冷凍干燥后用沸水3次提取后蒸干后得到水提物，將提取物用二甲基亞砜（DMSO）溶解后待用。

1.2 癌細(xì)胞株

MCF-7人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7 human breast adenocarcinoma cells）購自ATCC（美國典型培養(yǎng)物保藏中心，美國）。

1.3 試劑

DMSO為日本純正化學(xué)株式會(huì)社產(chǎn)品，D-Biotin、L-histidine·HCI（monohydrate）、D-glucose-6-phosphate（mono sodium salt）、NADP （sodium salt）、Paraformaldehyde、4，6-diamidino-2-phenylindole、ethidium bromide均購自美國Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)液、Fetal b ovine serum（FBS）、0.05%trypsin-0.02%EDTA、100unit/mL Penicillin-Streptomycin均購自美國GIBCO公司。Trizol reagent購自美國Invitrogen公司，蛋白檢測(cè)試劑盒購自美國Bio-Rad公司，western抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.4 儀器與設(shè)備

R-114旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司；VS-15CFN冷凍離心機(jī)：韓國Vision科學(xué)株式會(huì)社；MC096二氧化碳培養(yǎng)箱：日本三洋電機(jī)株式會(huì)社；HB-402V超凈工作臺(tái)、HB-205SW恒溫水浴震蕩器：韓國Hanbeak科學(xué)株式會(huì)社；PM-1OAK倒置顯微鏡、BXS0熒光顯微鏡：日本奧林巴斯株式會(huì)社；Elx800酶標(biāo)儀：美國Bio Tekinstruments公司。

1.5 方法

1.5.1 MTT法癌細(xì)胞體外增殖抑制試驗(yàn)

將MCF-7人乳腺癌細(xì)胞接種于含10%滅活小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在5%CO2、37℃充分濕化條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周更換2～3次培養(yǎng)基，6 d～7 d傳代一次。將培養(yǎng)的癌細(xì)胞按1×104個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔 180 μL。5%CO2、37℃充分濕化條件下培養(yǎng)24 h。細(xì)胞貼壁后按每孔20 μL加入樣品?？變?nèi)試驗(yàn)時(shí)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)劑量組，分別為50、100、200 μg/mL。48 h 培養(yǎng)后，每孔加入 20 μL MTT 試劑（質(zhì)量濃度為5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，結(jié)束培養(yǎng)后吸棄孔內(nèi)上清液后，按每孔150 μL加入DMSO后震蕩30 min，540 nm波長下用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD值并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率=[（空白孔OD值-樣品孔OD 值）/空白孔 OD 值]×100%[8]。

1.5.2 DAPI熒光染色的癌細(xì)胞凋亡觀察

經(jīng)樣品處理后的癌細(xì)胞用PBS洗后用3.7%的多聚甲醛（Paraformaldehyde）常溫下固定細(xì)胞10 min，然后用熒光染料 4，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）溶液染色10 min。用PBS溶液漂洗染色后的細(xì)胞2次，熒光顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并拍照[9]。

1.5.3 Reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）分析

同等條件下用RNAzol試劑制備MCF-7人乳腺癌細(xì)胞總RNA。定量分離到RNA后，以oligo dT為引物，在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下制備ss cDNA，然后以該cDNA為模板，RT-PCR 法擴(kuò)增 Bax，Bcl-2，caspase-3，9基因（表1）。持家基因glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase（GAPDH）作為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，以1%瓊脂電泳（含濃度溴化乙錠）檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物[10]。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Primers of RT-PCR

1.5.4 Western blot分析

用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后，分離上清，用蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取30 μg～50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，電印跡至硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜上。將印跡的NC膜依次進(jìn)行封閉、與第一抗體、第二抗體結(jié)合，抗體結(jié)合區(qū)帶用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲茶的體外抗癌作用試驗(yàn)效果

采用MTT法，檢測(cè)蟲茶的體外抗癌效果。結(jié)果顯示，蟲茶水提取物對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞具有一定的抑制作用，且抑制效果隨樣品質(zhì)量濃度增加而增加。以200 μg/mL濃度處理MCF-7人乳腺癌細(xì)胞時(shí)，表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制率（78%）。以100、50 μg/mL濃度處理M CF-7人乳腺癌細(xì)胞時(shí)，癌細(xì)胞生長抑制率分別為43%和11%（表2）。由此可見，蟲茶對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞具有增殖抑制效果，濃度較高時(shí)抑制效果更顯著。

表2 MTT法測(cè)定蟲茶對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的生長抑制效果Table 2 Inhibition of the growth of MCF-7 human breast adenocarcinoma cells by sandy tea as evaluated by MTT assay

2.2 蟲茶誘發(fā)癌細(xì)胞凋亡的效果

DAPI染色后，凋亡細(xì)胞核能發(fā)出藍(lán)色熒光，通過觀察細(xì)胞著色情況我們即可判定細(xì)胞是否凋亡。對(duì)照組MCF-7人乳腺癌細(xì)胞染色后細(xì)胞核邊緣清晰，著色均勻。經(jīng)蟲茶水提取物不同濃度（200、100、50 μg/mL）處理后的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞均出現(xiàn)了細(xì)胞邊緣不規(guī)則、細(xì)胞核濃染、凋亡小體等典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，而其中以200 μg/mL濃度作用下表現(xiàn)的更為明顯，見圖1。

圖1 經(jīng)蟲茶處理后MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡情況Fig.1 Appearance of apoptotic body in MCF-7 human breast adenocarcinoma cells treated with sandy tea

可見蟲茶對(duì)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡具有很強(qiáng)的作用，且以200 μg/mL濃度的作用效果明顯。

2.3 蟲茶葉對(duì)Bax，Bcl-2和caspases基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)影響

蟲茶水提取物以不同濃度處理MCF-7人乳腺癌細(xì)胞，以200 μg/mL濃度處理過的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞Bax，caspase-3和caspase-9表達(dá)最強(qiáng)，以100和50 μg/mL質(zhì)量濃度處理過的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞中Bax，caspase-3和caspase-9表達(dá)呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)；Bal-2的mRNA表達(dá)中，經(jīng)不同質(zhì)量濃度樣品處理后，隨著濃度的升高表達(dá)減弱。由此可以看出，在200μg/mL質(zhì)量濃度處理下蟲茶對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的凋亡作用強(qiáng)于其他濃度（圖2）。

圖2 經(jīng)蟲茶處理后MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的Bax，Bcl-2和caspases的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)Fig.2 Effects of sandy tea on the mRNA and protein expression of Bax，Bcl-2 and caspases in MCF-7 human breast adenocarcinoma cells

3 討論

蟲茶作為一種保健茶葉飲品，其部分功能性已經(jīng)得到證實(shí)。乳腺癌是女性排名第一的常見惡性腫瘤，除了醫(yī)學(xué)的治療手段外，通過堅(jiān)持食用保健食品可以預(yù)防和幫助治療乳腺癌已經(jīng)得到證實(shí)[12]。對(duì)癌細(xì)胞增值的體外作用可以從一定程度上證明保健食品的癌預(yù)防效果。本文中隨著蟲茶樣品濃度的增加MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的增值減少，證明蟲茶可以明顯的在體外抑制癌細(xì)胞的生長。細(xì)胞凋亡是在生理或病理?xiàng)l件下，由基因調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)程序化死亡過程。在癌癥發(fā)生過程中凋亡相關(guān)基因的突變或表達(dá)異常可以阻斷癌細(xì)胞的凋亡，促使癌癥發(fā)生[13]。Bcl-2基因是一種原癌基因，它具有抑制凋亡的作用。Bcl-2可與促凋亡Bax形成二聚體，Bax相對(duì)量高于Bcl-2時(shí)，Bax同二聚體的數(shù)量增多，從而促進(jìn)細(xì)胞死亡[14]。本研究中隨著處理癌細(xì)胞的蟲茶濃度的增加，癌細(xì)胞的Bax表達(dá)加強(qiáng)，Bcl表達(dá)減弱，可以認(rèn)為蟲茶可以促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，從而起到對(duì)乳腺癌的預(yù)防作用。Caspase基因選擇性地切割某些蛋白質(zhì)，從而造成細(xì)胞凋亡，caspase-9為凋亡途徑的上游caspase，caspase-3為下游caspase，caspase-9作為啟動(dòng)性caspase，隨著表達(dá)的加強(qiáng)可以加強(qiáng)對(duì)下游caspase-3的激活，caspase-3可直接降解胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，引起凋亡[15]。由此可以看出蟲茶對(duì)癌細(xì)胞的caspase-3和9的作用可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。本文以貴州蟲茶為基準(zhǔn)進(jìn)行了體外抗癌效能比較實(shí)驗(yàn)，得出蟲茶具有很強(qiáng)的體外抗癌效果的結(jié)果。蟲茶對(duì)動(dòng)物的抗癌效果和對(duì)人體的臨床作用也有待更深層次的研究。

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