劉春喜，王 儀，郅克謙，王志瑜(西安交通大學口腔醫(yī)院頜面外科，西安 70004;西安市第四醫(yī)院口腔科;西安交通大學校醫(yī)院口腔科;通訊作者，E-mail:liuchx70004@6.com)

涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)約占涎腺惡性腫瘤的 27% 左右［1］，具有極強的侵襲性，早期即可侵犯血管和神經(jīng)，而且還易發(fā)生遠處轉移，以肺轉移最為常見，轉移率高達40%。目前臨床對于SACC的治療主要采取手術聯(lián)合放療，但遠期療效仍不甚理想。近年來多數(shù)研究認為SACC的形成是由多種腫瘤相關基因的異常表達所引起，但具體的分子機制仍不清楚［2，3］。miRNAs是一類小分子非編碼RNA，主要通過轉錄后水平調控下游靶基因的mRNA的3’UTR(3’-非編碼區(qū))，目前研究已經(jīng)證實多數(shù)miRNAs位于抑癌基因或致癌基因相關染色體區(qū)域，其異常表達很容易激發(fā)腫瘤的發(fā)生［4］。miR-26a在多種人類腫瘤中均呈下調趨勢，miR-26a的過表達可以通過抑制多個下游靶基因的表達來調控腫瘤細胞的增殖和轉移［5，6］。本研究采用生物信息學的方法預測出miR-26a與EZH2(Enhancer of zeste homolog 2)的3’UTR區(qū)域存在良好的堿基互補關系，在此基礎上構建miR-26a和EZH2相應真核表達載體，并通過熒光實時定量PCR(qRT-PCR)、MTT、雙熒光素酶報告基因檢測和Western blot方法檢測miR-26a對腺樣囊性癌ACC-M細胞增殖能力的影響及其對下游EZH2的靶向作用。

1 材料和方法

1.1 材料

涎腺腺樣囊性癌細胞株ACC-M、E.coli DH5α、pcDNATM6.2和pmirGLO真核表達載體均來源于西安交通大學實驗中心，Hin dⅢ、Eco RⅠ、SacⅠ和XhoⅠ四種限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，逆轉錄試劑盒和SYBR熒光染料均購自Takara公司(中國)，質粒抽提及凝膠回收試劑盒購買自QIAGEN(北京)公司(中國)，脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000(美國)和TRIzol購自Invitrogen公司(美國)，MTT購自Sigma公司(美國)，雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)購自Promega公司(美國)，蛋白裂解液(RIPA)、10×annealing Buffer和 SDS-PAGE凝膠均購自碧云天生物技術公司，PVDF膜和蛋白發(fā)光液購自 Millipore公司(美國)，DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購自 Hyclone公司(中國)，兔抗人EZH2(#5246)購自Cell Signaling公司(美國)，小鼠抗人β-actin抗體購自Santa Cruz公司(美國)，二抗羊抗兔(小鼠)抗體均購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 miR-26a和EZH2真核表達載體構建 首選于 miRbase網(wǎng)站(http://www.mirbase.org/)檢索hsa-miR-26a的前體pre-miR-26a的頸環(huán)序列(GUGGCCUCGUUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCUGUGCAG GUCCCAAUGGGCCUAUUCUUGGUUACUUGCACGG GGACGC)，將所有“U”均變?yōu)椤癟”，同時設計該序列的互補鏈，在兩條序列兩段添加Hin dⅢ和Eco RⅠ酶切位點。此外，采用TARGETSCAN-VERT(http://www.targetscan.org/)證實 miR-26a 與備選靶基因 EZH2(ACUUUGAAUAAAGAAUACUUGAA)具有良好的堿基互補配對關系，在該序列及其互補序列兩側添加SacⅠ和XhoⅠ雙酶切位點。同時將miR-26a與EZH2互補的種子區(qū)進行堿基突變。堿基序列由上海生物工程股份有限公司合成，annealing Buffer 95℃，4 min退火成雙鏈。將 pcDNATM6.2-GW質粒采用Hin dⅢ和Eco RⅠ進行雙酶切，pmirGLO質粒采用SacⅠ和XhoⅠ雙酶切，然后回收酶切后的大片段，采用T4 DNA連接酶連接pre-miR-26a與 pcDNATM6.2大片段構建 pcDNATM6.2-pre-miR-26a重組載體;同時應用 T4 DNA連接酶將EZH2野生型(EZH2-WT)和突變型(EZH2-MT)載體與pmirGLO大片段鏈接為pmir-GLO-EZH2-WT和pmirGLO-EZH2-MT重組載體，16℃過夜。將連接產(chǎn)物轉化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆、擴增、提取重組質粒，送至上海生物工程股份有限公司測序鑒定。

1.2.2 熒光實時定量 PCR(qRT-PCR)檢測 miR-26a在腺樣囊性癌ACC-M細胞中的表達及其對EZH2的影響 腺樣囊性癌ACC-M細胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)，5%CO2，37℃，恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)期ACC-M細胞進行消化，將其種于6孔板，每孔約4×105個細胞，將ACC-M細胞分為兩組，其中一組不進行任何處理設為對照組，另一組按照LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑說明書將pre-miR-26a轉染至ACC-M細胞，4 h后更換培養(yǎng)基，24 h采用Trizol提取總RNA，逆轉錄條件為RNA 500 ng，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s 10 μl體系，擴增條件為95℃ 10 min，1 min預變性，95℃ 15 s，60℃30 s，72 ℃ 45 s，重復40 個循環(huán)，20 μl體系，檢測 premiR-26a在ACC-M細胞中的轉染效率，其中miR-26a的逆轉錄引物為:GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAGCCTAT，上游引物為 ATCCAGTGCGTGTCGTG，下游引物為TGCTTTCAAGTAATCCAGG，U6設為內(nèi)參。此外，將ACC-M細胞分為兩組分別轉染pcDNATM 6.2空載體(Neg-miR)和 pcDNATM6.2-pre-miR-26a重組質粒(pre-miR-26a)，采用上述qRT-PCR的方法檢測miR-26a對EZH2 mRNA表達量的影響，其中EZH2的上游引物為5’-GGGAAGAAATCTGTGTGTTGGAA-3’，下游引物為:5’-TGTGTTGGAAAATCCAAGTCA-3’，β-actin作為內(nèi)參。qRT-PCR的結果分析采用 2-ΔΔCt計算方法。

1.2.3 采用 MTT法分析 miR-26a對 ACC-M 細胞增殖的影響 將(3-5)×103個ACC-M細胞接種于96孔板，根據(jù)LipofectamineTM2000操作說明分別轉染Neg-miR和pre-miR-26a，4-6 h更換培養(yǎng)基，37℃孵育，分別于24 h、48 h和72 h對各孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)孵育4 h后棄掉上清，加入150 μl DMSO檢測各孔的OD值，各組設3個復孔。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因檢測miR-26a與EZH2的靶向關系 將對數(shù)期ACC-M細胞以每孔(3-5)×103個種于96孔板中，將其分為四組Neg-miR+EZH2-WT，Neg-miR+EZH2-MT，pre-miR-126+EZH2-WT，pre-miR-126+EZH2-MT。37℃孵育24 h后棄掉上清，根據(jù)Promega公司雙熒光素酶基因檢測試劑盒說明書向各孔內(nèi)加入螢火蟲和海腎熒光素酶試劑，檢測各孔的熒光活性。

1.2.5 Western blot檢測 miR-26a對 EZH2 蛋白水平的影響 將轉染Neg-miR和pre-miR-26a質粒24 h后的ACC-M細胞胰酶消化離心，PBS洗2遍，按照RIPA裂解液說明書提取ACC-M總蛋白，并測定其濃度。采用10%的SDS-PAGE凝膠，蛋白上樣量為20 μg，采用濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，EZH2(1∶1 000)4℃過夜孵育，二抗(1∶3 000)室溫孵育1.5 h，TBST 洗膜10 min ×3次，Millipore蛋白液發(fā)光觀察EZH2蛋白表達情況，β-actin作為內(nèi)參蛋白。

1.2.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。細胞實驗重復3次，采用t檢驗進行數(shù)據(jù)分析，Iamge J分析蛋白表達量，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-26a與EZH2重組質粒構建成功

如圖1A所示，將構建的pre-miR-26a重組質粒測序報告，通過NCBI BLAST進行比對后證實載體構建成功，并未見堿基突變或缺失。同時將構建的pre-miR-26a轉染入ACC-M細胞，采用qRT-PCR方法發(fā)現(xiàn)轉染pre-miR-26a的ACC-M細胞中miR-26a的表達要顯著高于未轉染細胞(P＜0.001，圖1B)，提示構建的pre-miR-26a具有較高的轉染效率，可用于后續(xù)試驗。此外，對pmirGLO-EZH2-WT和pmir-GLO-EZH2-MT重組質粒也進行BLAST序列比對，無堿基缺失或突變，均構建成功(圖1C、D)。

圖1 miR-26a與EZH2重組質粒的表達及測序結果Figure 1 The expression of recombinant plasmids of miR-26 and EZH2 and sequencing results

2.2 miR-26a抑制ACC-M細胞的增殖活性

采用MTT方法分別檢測轉染Neg-miR和premiR-26a的ACC-M細胞在24 h、48 h和72 h后的OD值。轉染pre-miR-26a的ACC-M細胞在48 h(P=0.015)和72 h(P ＜0.001)的增殖活性要顯著低于轉染空質粒組(見圖2)。提示miR-26a能夠顯著抑制ACC-M細胞的增殖活性。

2.3 miR-26a靶向調控EZH2的表達

圖2 miR-26a對ACC-M細胞增殖活性的影響Figure 2 The effect of miR-26a on proliferation of ACC-M cells

采用生物信息學的方法，在Targetscan網(wǎng)站提示miR-26a與EZH2之間存在良好的堿基互補靶向關系，同時在此基礎上對互補的種子區(qū)進行突變，設計EZH2的突變型載體(圖3A)。將pre-miR-26a分別與EZH2-WT和EZH2-MT載體共轉染ACC-M細胞，雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示共轉染premiR-26a+EZH2-WT的ACC-M細胞其熒光活性顯著降低(P=0.001，圖3B)。此外，采用qRT-PCR和Western blot的方法分別檢測了轉染 Neg-miR和pre-miR-26a的ACC-M細胞中EZH2的mRNA和蛋白水平，轉染pre-miR-26a的ACC-M細胞其EZH2的mRNA水平(P=0.001，圖3 C)和蛋白表達顯著低于對照組(P=0.006，圖 3D)。

圖3 miR-26a與EZH2的靶向關系Figure 3 The target relationship between miR-26 and EZH2

3 討論

目前已經(jīng)證實多種腫瘤相關基因的異常表達可引起涎腺腺樣囊性癌(SACC)的發(fā)生，并且與預后密切相關。正如Braz?o-Silva等學者［7］發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白在轉移性SACC患者的表達顯著高于非轉移者，該基因的高表達與患者的惡化程度和不良預后密切相關。另外在SACC中發(fā)現(xiàn)跨膜絲氨酸蛋白酶4(TMPRSS4)的高表達與患者的TNM分期、淋巴結轉移及遠處轉移均有關，并且可以作為整體生存率和無病生存率的獨立預后指標［8］。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNAs的異常表達也與SACC的發(fā)生發(fā)展有關。miR-181a能夠通過直接靶向MAPKSnai2抑制SACC細胞的遷移、侵襲和增殖，并且體內(nèi)實驗進一步發(fā)現(xiàn)miR-181a除抑制腫瘤生長外，還能抑制 SACC細胞的肺轉移［2］。然而目前有關miRNAs在SACC中的研究仍然很少。

miR-26a作為抑癌基因在多種人類腫瘤中呈低表達狀態(tài)，目前有關miR-26a在腫瘤發(fā)生過程中的作用機制研究主要是采用構建miR-26a過表達載體實現(xiàn)的。過表達的 miR-26a可以通過直接靶向Lin28B、Zcchc11或FGF9抑制不同腫瘤細胞的生長及轉移，并且通過對臨床標本的檢測可以發(fā)現(xiàn)miR-26a表達下調與患者臨床分期、淋巴結轉移和不良預后密切相關［5，9］。SACC 以往的機制性研究多集中在腫瘤細胞的侵襲、轉移方面，而對其增殖方面的研究甚少，尤其是miR-26a目前在SACC中尚未見相關報道。本研究成功構建了miR-26a過表達載體，將其轉染入ACC-M細胞后，MTT分析顯示miR-26a的過表達可以顯著抑制ACC-M細胞的增殖活性，但是在調控過程涉及哪些相關蛋白的表達尚不確定。

本研究采用生物信息學的方法預測出miR-26a的候選靶基因EZH2(enhancer of Zeste homolog 2)，EZH2屬于PcG(Polycomb group)家族成員之一，在多種腫瘤中呈高表達，可以促進腫瘤細胞的增殖及瘤細胞的轉化［10，11］。EZH2既可以通過抑制 TIMP-3(metalloproteinase-3)的表達抑制非小細胞肺癌細胞的遷移［12］，還可以通過下調p16和p27的表達促進膽管癌細胞的周期進展，并抑制凋亡的發(fā)生［13］。然而，目前為止有關EZH2在SACC中的相關機制研究尚未見相關報道。本研究成功構建了EZH2野生型和突變型真核表達載體，并將其與pre-miR-26a和空載體共轉染ACC-M細胞后發(fā)現(xiàn)共轉染premiR-26a和EZH2-WT的ACC-M細胞其熒光活性檢測顯著下降。在此基礎上采用qRT-PCR和Western blot方法進一步驗證了miR-26a能夠在mRNA和蛋白水平下調EZH2的表達，從而提示miR-26a的過表達在ACC-M細胞中可以通過靶向降解EZH2的mRNA水平引起蛋白表達的下降，從而抑制ACC-M細胞的增殖活性。

綜上所述，本研究已成功構建了miR-26a和EZH2相應真核表達載體，并采用qRT-PCR驗證了pre-miR-26a在ACC-M細胞中具有較高的轉染效率，MTT分析提示miR-26a過表達能夠顯著抑制ACC-M細胞的增殖活性，同時雙熒光素酶報告基因檢測、qRT-PCR和Western blot進一步證實了miR-26a可以降解EZH2的mRNA水平從而下調EZH2的蛋白表達，提示二者之間存在良好的靶向關系。

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