馬一倩，汪 莉，馬 宏，李保存，趙桂花(青海衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理學(xué)系，青海 80000;天津市兒童醫(yī)院消化內(nèi)科;通訊作者，E-mail:mayiqian680504@63.com)

胃癌是嚴(yán)重危害人體的惡性腫瘤之一，我國(guó)胃癌發(fā)病率和死亡率均高于全球平均水平，嚴(yán)重威脅人民的生命和健康，并造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及損失［1］。機(jī)體細(xì)胞凋亡的調(diào)控障礙是胃癌發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一，F(xiàn)as相關(guān)因子1(Fas-associated factor 1，F(xiàn)AF1)是一種能夠誘導(dǎo)Fas 介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的促凋亡蛋白，多項(xiàng)研究表明其在胃癌組織中特異性低表達(dá)［2-4］;Livin基因是最新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，IAP)，能與多種caspase結(jié)合而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生［5］。研究二者在胃癌中的表達(dá)水平及其相關(guān)性對(duì)揭示胃癌發(fā)生機(jī)制有著指導(dǎo)意義，為進(jìn)一步探索胃癌的診斷、治療提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2011-12～2012-05青海大學(xué)附屬醫(yī)院53例胃癌患者的腫瘤組織手術(shù)標(biāo)本(經(jīng)病理證實(shí))作為研究對(duì)象(胃癌組)，其中最大年齡76歲，最小年齡33歲，平均(56.34±10.98)歲。所有胃癌患者術(shù)前未經(jīng)過(guò)放、化療。同時(shí)收集正常胃黏膜組織標(biāo)本50例設(shè)為對(duì)照組，對(duì)照組年齡、性別與胃癌組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2 主要試劑

實(shí)驗(yàn)用試劑兔抗人FAF1多克隆抗體(稀釋濃度為1∶400)購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司;兔抗人Livin多克隆抗體及SABC免疫試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 主要方法

準(zhǔn)備石蠟切片:標(biāo)本收集后經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，石蠟切片機(jī)連續(xù)4 μm切片三張，烤片機(jī)干燥30 min，60℃恒溫烤箱烘烤過(guò)夜。第一張切片經(jīng)二甲苯和不同梯度酒精脫蠟后進(jìn)行HE染色、脫水及封固后閱片。第二、三張切片采用免疫組化染色SP法:切片常規(guī)脫蠟后0.01 mol/L檸檬酸加熱修復(fù)抗原，自然冷卻至室溫;0.3%H2O2室溫下孵育10 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，0.01 mol/L PBS液緩沖3次，間隔時(shí)間5 min;滴加一抗后置于37℃溫箱孵育2 h，室溫下復(fù)溫20 min;PBS液緩沖3次后滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔或抗鼠抗體，37℃溫箱孵育30 min后緩沖三次;DAB液顯色后復(fù)染、返藍(lán)，最后脫水、封固閱片。用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

FAF1、Livin蛋白陽(yáng)性染色均見于細(xì)胞質(zhì)中，為棕黃色顆粒。FAF1蛋白及Livin蛋白表達(dá)水平按照半定量記分方法，每例隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(×400)。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)分:陽(yáng)性細(xì)胞≤5%為0分，6%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，＞75%為4分;陽(yáng)性強(qiáng)度積分:無(wú)著色為0分，黃色為1分，棕黃為2分，棕褐色為3分;陽(yáng)性分級(jí):將陽(yáng)性細(xì)胞率與染色強(qiáng)度兩者積分相乘0分為(-)，1 分為(+)，2-4 分為(++)，5-8 分為(+++)，9-12 分為(++++);其中(-)-(+)為陰性，(++)-(++++)為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組之間FAF1、Livin蛋白表達(dá)水平之間的差異性采用χ2檢驗(yàn)分析，二者相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 FAF1、Livin蛋白在胃癌組織中的表達(dá)

FAF1、Livin蛋白均見于細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)(圖1，2，見第247頁(yè))FAF1在胃癌組的表達(dá)水平明顯低于正常組(χ2=32.30，P ＜0.05);Livin 蛋白在胃癌組的表達(dá)水平明顯高于正常組(χ2=36.96，P ＜0.05，見表1)。

圖1 FAF1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)Figure 1 Expression of FAF1 protein in gastric cancer tissues

圖2 Livin蛋白在胃癌組織中的表達(dá)Figure 2 Expression of Livin protein in gastric cancer tissues

表1 FAF1、Livin蛋白在胃癌組及正常組的表達(dá)例(%)Table 1 Expression of FAF1 and Livin protein in gastric cancer cases(%)

2.2 FAF1、Livin蛋白在胃癌不同臨床病理特征中的表達(dá)

FAF1蛋白在高、中分化組的表達(dá)水平高于低、未分化組(P＜0.05);Livin蛋白在腫癌＞5 cm組、浸潤(rùn)至漿膜層組、低-未分化組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、TNM分期Ⅲ-Ⅳ組的陽(yáng)性表達(dá)水平分別高于癌腫≥5 cm組、浸潤(rùn)至肌層組、高-中分化組、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組、TNM分期Ⅰ-Ⅱ組(P＜0.05，見表2)。

2.3 FAF1、Livin蛋白在胃癌組織中的表達(dá)相關(guān)性

經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，胃癌組織中FAF1與Livin蛋白的表達(dá)無(wú)相關(guān)性(rs=0.307，P＞0.05)。

3 討論

機(jī)體細(xì)胞凋亡的調(diào)控障礙是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一。FAF1蛋白是一種促凋亡因子［1］?？纱嬖谟诓煌?xì)胞的細(xì)胞核和/或胞質(zhì)中，定位于染色體1q32區(qū)，由650個(gè)氨基酸組成［2，3］。其181-381位氨基酸序列可以與Fas介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑中的FADD(Fas associated death domain，F(xiàn)as相關(guān)死亡區(qū)域)和半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)的DED區(qū)(death effecter domain，死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域)相互作用，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生;其次還可以與蛋白激酶CK2結(jié)合成復(fù)合物，當(dāng)DNA受損時(shí)抑制CK2作用，從而使凋亡顯著增加［6，7］。多位學(xué)者研究FAF1蛋白在人類不同器官腫瘤中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)FAF1只在胃癌組織中是特異性低表達(dá)［8］，其在胃癌的早期診斷中的作用逐漸引起研究者的重視。Livin基因是最新發(fā)現(xiàn)的 IAP家族成員，定位于染色體20q13，其氨基端的BIR結(jié)構(gòu)域包含抗凋亡所必需的半胱氨酸和組氨酸的復(fù)合物，可以與caspases家族中的多個(gè)成員相互作用，從而抑制caspase級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生［5］。多項(xiàng)研究證實(shí)Livin蛋白在正常成人大多數(shù)終末分化組織中低表達(dá)或不表達(dá)，在喉癌、黑色素瘤、胰腺癌、肺癌等許多腫瘤及胚胎組織中呈高表達(dá)［9-14］，目前國(guó)內(nèi)對(duì)FAF1、Livin蛋白在胃癌組織中的表達(dá)相關(guān)性研究少有報(bào)道，而應(yīng)用Livin的基因治療成為研究熱點(diǎn)。

表2 FAF1、Livin蛋白在胃癌不同臨床病理特征中的表達(dá)Table 2 Relationship between FAF1，Livin protein expression and clinicopathological features of gastric cancer

本研究結(jié)果顯示:FAF1蛋白在胃癌組織的表達(dá)水平明顯低于正常組織，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=36.96，P ＜0.05)。此結(jié)果與劉愛群等［15］研究結(jié)果基本一致，但表達(dá)率略低。FAF1蛋白的表達(dá)水平與胃癌細(xì)胞分化程度有關(guān)，細(xì)胞分化程度越低FAF1蛋白表達(dá)水平就越低，此結(jié)果與王曉鳳等［16］研究結(jié)果相同。提示FAF1的表達(dá)缺失可能抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，阻礙了細(xì)胞分化，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性增生而發(fā)生胃癌。結(jié)合研究顯示FAF1僅在人胃癌中特異性低表達(dá)，認(rèn)為監(jiān)測(cè)FAF1的表達(dá)水平可能為胃癌的早期發(fā)現(xiàn)及判斷分化程度提供重要依據(jù);FAF1蛋白在不同年齡、性別、腫瘤部位、淋巴轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、腫瘤大小、TNM分期等各組間未見明顯差異(P＞0.05)。此結(jié)果與王健莉等［17］研究顯示FAF1蛋白的表達(dá)水平與腫瘤大小有關(guān)不符，有待今后進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示:Livin蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常胃黏膜組織，二者比較具有顯著性差異(χ2=36.96，P ＜0.05)。提示 Livin 的高表達(dá)增加了腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力，促進(jìn)了其惡性增殖，導(dǎo)致了胃癌的發(fā)生。Livin在癌腫＞5 cm組、浸潤(rùn)至漿膜層組、低-未分化組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、TNM分期Ⅲ-Ⅳ組的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌腫＜5 cm組、浸潤(rùn)至肌層組、高-中分化組、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組、TNM分期Ⅰ-Ⅱ組 (P＜0.05)。此結(jié)果與Liu等研究結(jié)果相似［18］。提示胃癌患者Livin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率增高，則胃癌惡性程度高、易發(fā)生轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道Livin蛋白的表達(dá)有腫瘤組織特異性，認(rèn)為監(jiān)測(cè)Livin蛋白的表達(dá)水平可能為胃癌的診斷及預(yù)后判斷提供重要依據(jù)，同時(shí)隨著有關(guān)研究的進(jìn)一步深入，以Livin為靶向的基因治療將為胃癌的治療開辟新途徑。

FAF1、Livin蛋白之間經(jīng)相關(guān)性分析顯示二者表達(dá)無(wú)相關(guān)性，提示FLIP蛋白和Livin蛋白雖然都作用于細(xì)胞凋亡過(guò)程中，但在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中二者之間可能無(wú)相互協(xié)同或抑制作用。

綜上所述，F(xiàn)AF1和Livin蛋白在胃癌發(fā)生、發(fā)展中分別起促進(jìn)和抑制細(xì)胞凋亡的作用，而二者之間無(wú)相互協(xié)同或抑制作用。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AF1在人胃癌中呈特異性低表達(dá)，而Livin蛋白的表達(dá)有腫瘤組織特異性，因此監(jiān)測(cè)FAF1和Livin蛋白的表達(dá)水平可能為胃癌的早期發(fā)現(xiàn)及推斷演進(jìn)方向提供重要依據(jù)，同時(shí)以Livin為靶向的基因治療為胃癌的治療帶來(lái)新思路。

致謝：本研究在青海大學(xué)附屬醫(yī)院消化科及病理科的大力協(xié)助下完成，特此表示感謝!

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