張慶慶 張森林 朱迎蘭 董震 曹罡 陳偉

1.南方醫(yī)科大學(xué)南京臨床醫(yī)學(xué)院口腔科；2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院口腔科，南京 210002

涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是涎腺常見的惡性腫瘤，國內(nèi)統(tǒng)計其占涎腺腫瘤的9.9%[1]，國外統(tǒng)計其占涎腺腫瘤的7.5%[2]。SACC的惡性程度高，主要表現(xiàn)為侵襲性強(qiáng)，局部易復(fù)發(fā)；易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，以肺轉(zhuǎn)移多見，轉(zhuǎn)移率高達(dá)40%；有典型嗜神經(jīng)性，早期即可沿神經(jīng)侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致面癱、麻木、疼痛等神經(jīng)受損癥狀，給臨床治療帶來很大的困難，預(yù)后差[2]。本課題前期研究已成功構(gòu)建了SACC嗜神經(jīng)侵襲基因表達(dá)譜，Notch-1即為其中重要差異表達(dá)基因之一[3]。

Notch信號途徑是一個進(jìn)化上保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖與凋亡中起重要作用。Notch信號途徑的異常調(diào)控可引起組織的發(fā)育異常，并最終導(dǎo)致腫瘤等多種疾病的發(fā)生[4]。研究[5]表明，Notch家族基因Notch-1、Notch-2、Notch-4與SACC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有關(guān)，但其與SACC嗜神經(jīng)侵襲行為間的關(guān)系尚未見報道。本研究的目的是構(gòu)建人Notch-1基因的RNA干擾（RNA interference，RNAi）慢病毒載體，并對其進(jìn)行鑒定，尋找最佳RNAi慢病毒載體，為探討Notch-1在SACC中的功能與分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料

慢病毒載體pLenOR-THM（上海英為信生物科技有限公司），配有3個包裝質(zhì)粒pRsv-REV、pMDlgpRRE、pMD2G。Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ（Takara公司，日本），T4 DNA連接酶（NEB北京有限公司），AxyPrep質(zhì)粒小量制備試劑盒（Axygen公司，美國），Nucleo-Bond Xtra Midi Plus質(zhì)粒純化試劑盒（Macherey-Nagel公司，德國），高效感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒（上海生物工程有限公司），大腸桿菌菌株DH5α、RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基、LipofectaminTM2000、胰蛋白酶、Trizol（Invitrogen公司，美國），M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Fermentas公司，加拿大），SYBR Master Mixture（Toyobo公司，日本），胎牛血清（PAA公司，美國）。兔抗人Notch-1、GAPDH抗體（Abcam公司，英國），HRP標(biāo)記的山羊抗兔多抗、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（Pierce公司，美國）。包裝細(xì)胞293T細(xì)胞株、ACC-M細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞所，寡核苷酸及引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.2 靶向Notch-1基因的寡核苷酸設(shè)計

針對人Notch-1基因序列（GenBank：NM_004-557.3），按照RNAi序列設(shè)計原則[6-7]，設(shè)計RNAi靶點(diǎn)序列（shRNA1～3），同時設(shè)計一段陰性對照序列（NC），經(jīng)BLAST分析表明其均不與人任何其他cDNA序列同源。再根據(jù)以上4段序列分別設(shè)計合成4對寡核苷酸序列，每對包含一條正義鏈（sense）和一條反義鏈（antisense）（表1）。4對寡核苷酸序列退火后均可形成在5’端含BamHⅠ酶切位點(diǎn)，3’端含EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，中間含21個堿基發(fā)夾環(huán)的小片段DNA雙鏈。

表1 針對人Notch-1基因序列設(shè)計的寡核苷酸對Tab 1 Oligonucleotide sequences of Notch-1 specific shRNAs

1.3 慢病毒載體pLenOR-THM-Notch-1的構(gòu)建、擴(kuò)增及鑒定

將pLenOR-THM載體用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ行雙酶切，將酶切產(chǎn)物用低熔點(diǎn)瓊脂糖膠回收并和上述寡核苷酸退火后的產(chǎn)物混合，然后經(jīng)T4 DNA連接酶連接過夜，從而將Notch-1基因序列插入慢病毒載體pLenOR-THM，構(gòu)建pLenOR-THMNotch-1重組載體。連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)菌，經(jīng)含氨芐青霉素培養(yǎng)基篩選陽性克隆后，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)。按分子克隆實(shí)驗(yàn)指南用堿裂解法手工抽提質(zhì)粒。由于靶RNA干擾序列插入位點(diǎn)是BamHⅠ和EcoRⅠ之間，酶切出的片段較小，不易于分辨，故設(shè)計重組載體中的KpnⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)，增大酶切出的片段長度，行雙酶切初步鑒定。使用Axygen試劑盒抽提質(zhì)粒并通過DNA測序（南京金斯瑞生物科技公司）進(jìn)一步鑒定。

1.4 包裝產(chǎn)生siRNA的病毒顆粒及測定病毒滴度

重組質(zhì)粒載體pLenOR-THM-Notch1、包裝質(zhì)粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G分別進(jìn)行去內(nèi)毒素中量質(zhì)粒抽提，并進(jìn)行濃度測定，同時設(shè)置空載體pLenOR-THM為對照。用脂質(zhì)體LipofectaminTM2000包裹慢病毒四質(zhì)粒系統(tǒng)（pLenOR-THM-Notch4、pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝。48～72 h后大量病毒產(chǎn)生，收取含病毒的培養(yǎng)液，并通過0.45 μm濾器過濾，4 ℃、12 000 g 離心20 min后棄上清，沉淀，即為Notch-1基因RNAi慢病毒載體，分裝后凍存于-80 ℃待用。將純化過的病毒倍比稀釋后（1、0.1、0.01 μL）感染293T細(xì)胞，48 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光。取0.1 μL病毒感染293T細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測陽性細(xì)胞比例，測定病毒滴度（TU·mL-1），即每毫升病毒原液含有具有感染能力的病毒顆粒的個數(shù)。以復(fù)感染系數(shù)（multiplicity ofinfection，MOI）為1時感染293T細(xì)胞，感染72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。在100倍光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的10個視野，手工計數(shù)發(fā)綠色熒光細(xì)胞占總細(xì)胞的比例，計算感染效率。

1.5 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reac-tion，PCR）檢測Notch-1 mRNA的表達(dá)

慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后，從6孔板中每組各收集細(xì)胞1×106個，采用Trizol一步法抽提總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后用ABI-7900型熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Real-Time PCR引物：Notch-1正義鏈為5’-AGTACTGTACCGAGGATGTGGACG-3’； 反義鏈為5’-GAAGGAGGCCACACGGTCAT-3’；GAPDH正義鏈為5’-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3’；反義鏈為5’-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3’。反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，58 ℃復(fù)性20 s，72 ℃延伸20 s，45個循環(huán)。ACC-M為陰性對照，空載體Notch-1 mRNA為空白對照。采用2-ΔΔCt法計算基因表達(dá)的相對比值。

1.6 Western blot檢測Notch-1蛋白表達(dá)

慢病毒轉(zhuǎn)染96 h后，6孔板中各組以預(yù)冷的PBS液洗3次，加入100 μL預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑的蛋白抽提試劑，刮匙收集樣本，4 ℃下10 000 g離心2 min，取上清，以BCA法測定提取蛋白濃度。每個樣本取50 μg蛋白加入等體積2×SDS上樣緩沖液，使用煮沸變性后預(yù)制的7.5% SDS-PAGE電泳分離，100 V×1 h濕法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)載標(biāo)本蛋白的硝酸纖維素膜浸入含5%脫脂奶粉的TTBS（20 mmol·L-1Tris-HCL，pH 7.4，150 mmol·L-1NaCl，0.1% Tween-20），室溫封閉1 h，加入一抗（兔抗人Notch-1、GAPDH抗體，1︰1 000） ，4 ℃振蕩孵育過夜，TTBS洗滌15 min×4次后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1︰5 000），室溫孵育1 h，充分洗滌后，電化學(xué)發(fā)光（electro-chemiluminescence，ECL）法檢測標(biāo)本膜上的信號，記錄結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。所有的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，組間兩兩單因素方差分析（one-way）比較采用ANOVA檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒載體pLenOR-THM-Notch-1的鑒定

重組載體經(jīng)KpnⅠ及EcoRⅠ雙酶切后，陽性克隆條帶大小為395 bp，陰性克隆條帶大小為330 bp（圖1）。鑒定結(jié)果與預(yù)期相符，說明目的片段已正確插入pLenOR-THM慢病毒載體。

圖1 重組載體經(jīng)Kpn Ⅰ及EcoR Ⅰ雙酶切鑒定結(jié)果Fig 1 Validation results of recombinant vector by Kpn Ⅰ and EcoRⅠdouble-digestion

DNA測序結(jié)果顯示，構(gòu)建的3個慢病毒載體均含有所設(shè)計的目的片段，其序列與設(shè)計的靶向Notch-1寡核苷酸序列完全一致，進(jìn)一步證實(shí)目的片段已正確插入pLenOR-THM慢病毒載體，重組慢病毒載體pLenOR-THM-Notch-1構(gòu)建成功（圖2）。

2.2 慢病毒包裝與病毒滴度測定

慢病毒載體四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后，熒光顯微鏡下可觀察到293T細(xì)胞發(fā)出大量綠色熒光。不同數(shù)量慢病毒感染293T細(xì)胞48 h后，其發(fā)出的綠色熒光強(qiáng)度不同（圖3）。慢病毒pLenOR-THM-Notch1濃縮后的病毒滴度約為5.8×108TU·mL-1。以MOI為1時感染293T細(xì)胞，感染72 h后熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，感染效率達(dá)到90%以上。

圖2 重組載體pLenOR-THM-Notch-1測序圖譜Fig 2 The sequencing atlas of recombinant vector pLenOR-THM-Notch-1

圖3 不同數(shù)量慢病毒感染293T細(xì)胞 熒光顯微鏡 × 100Fig 3 293T cells infected by different quantity of purified lentivirus fluorescence microscope×100

2.3 PCR檢測Notch-1 mRNA的表達(dá)

PCR檢測結(jié)果（圖4）表明，陽性對照組的Notch-1 mRNA表達(dá)水平與陰性對照組無統(tǒng)計學(xué)差異，pLenORNotch-1-shRNA1、2、3組的Notch-1 mRNA表達(dá)均低于對照組，其中pLenOR-Notch-1-shRNA1、3組降低最明顯。

2.4 Western blot檢測Notch-1蛋白的表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果（圖5）表明，pLenORNotch-1-shRNA1、3組與陰性對照組及陽性對照組相比，Notch-1蛋白表達(dá)明顯受到抑制，其中pLenORNotch-1-shRNA3組受抑制程度最高；pLenOR-Notch-1-shRNA2組與對照組相比，Notch-1蛋白表達(dá)未受抑制。

圖4 PCR檢測各組Notch-1 mRNA水平Fig 4 Notch-1 mRNA levels of each group analyzed by PCR

圖5 Western blot檢測各組Notch-1蛋白表達(dá)水平Fig 5 Notch-1 protein levels of each group analyzed by Western blot

3 討論

Notch家族基因于1919年在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，該基因的部分功能缺失會在果蠅翅膀的邊緣造成缺口（notch），Notch基因由此而得名。1991年，Notch-1在人類的T淋巴母細(xì)胞白血病中首先被鑒定出來，表明了Notch信號通路和腫瘤相關(guān)[8]。人類的很多腫瘤（如頭頸部腫瘤、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤等）、血液系統(tǒng)疾?。ㄈ缁羝娼鹆馨土觥淋巴細(xì)胞白血病等）及一些其他病變（如根尖囊腫）中均發(fā)現(xiàn)Notch基因及其配體的異常表達(dá)[9-13]。研究[14]表明，通過降低Notch基因的表達(dá)，可以抑制人鼻咽癌細(xì)胞系的體外增殖能力。Notch-1和Notch-4被認(rèn)為是乳腺癌的預(yù)測因素及潛在的基因治療靶點(diǎn)[15-16]。組織芯片研究表明，Notch-1在胃癌、胰腺癌中的表達(dá)與腫瘤的分化程度、浸潤深度等明顯相關(guān)，這可能是因?yàn)镹otch-1可促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子-κB的表達(dá)，而后者上調(diào)了基質(zhì)金屬蛋白酶-9及血管內(nèi)皮生長因子導(dǎo)致的浸潤[17-18]。研究[19-20]表明，Notch基因的過表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)，Notch基因可以作為頭頸部鱗狀細(xì)胞癌癌前病變診斷的候選基因和治療的新靶基因。

Notch信號通路與SACC的關(guān)系尚不明確。學(xué)者[5]用限制片段差異顯示PCR技術(shù)構(gòu)建了ACC-M和ACC-2細(xì)胞株的差異基因表達(dá)譜，認(rèn)為Notch家族基因Notch-1、2、4與SACC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有關(guān)。本課題前期研究中，結(jié)合激光俘獲顯微切割和人類全基因組芯片技術(shù)，首次成功構(gòu)建出SACC嗜神經(jīng)侵襲相關(guān)基因表達(dá)譜，并經(jīng)過聚類分析和基因功能分析發(fā)現(xiàn)，Notch基因在嗜神經(jīng)侵襲組中特異性高表達(dá)[3]，這與另外兩項(xiàng)SACC基因表達(dá)譜的研究結(jié)果[21-22]相符合。

RNAi的本質(zhì)是由發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）介導(dǎo)的與之同源的mRNA特異性降解，進(jìn)而抑制相應(yīng)基因表達(dá)的過程[23]。通過適當(dāng)?shù)募夹g(shù)生產(chǎn)特異性的siRNA并使其有效地作用于靶基因的mRNA，就能達(dá)到使該基因“沉默”的目的。生成siRNA的方法有化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄合成法、質(zhì)粒載體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)法和病毒載體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)法等。其中，慢病毒載體是在人類免疫缺陷病毒1基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，能高效地將目的基因?qū)雱游锖腿说脑?xì)胞或細(xì)胞系，其介導(dǎo)的基因表達(dá)作用持續(xù)且穩(wěn)定，目的基因能整合到宿主細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂[24-25]。

本實(shí)驗(yàn)成功地構(gòu)建了Notch-1基因RNAi慢病毒載體pLenOR-THM-Notch-1，并通過雙酶切及DNA測序加以鑒定；通過病毒包裝、收集和濃縮，得到高滴度慢病毒顆粒，經(jīng)測定濃縮后的病毒滴度約為5.8×108TU·mL-1；以MOI為1時感染293T細(xì)胞后，感染效率達(dá)90%以上。結(jié)合QRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果，pLenOR-Notch-1-shRNA3對Notch-1基因在mRNA及蛋白水平的抑制作用最為明顯。慢病毒載體pLenOR-THM-Notch-1的成功構(gòu)建為探討Notch-1基因在SACC中的生物學(xué)功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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