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        雙孢菇深層發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究

        2014-12-16 08:08:36劉曉鵬余麗瓊
        食品工業(yè)科技 2014年21期
        關(guān)鍵詞:雙孢菇無機(jī)鹽菌絲體

        劉曉鵬,姜 寧,馬 瓊,楊 洪,余麗瓊,張 馳

        (1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖北恩施445000;2.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北恩施445000)

        雙孢菇(Agaricus bisporus)屬于真菌界、擔(dān)子菌門、無隔擔(dān)子菌綱、傘菌目、傘菌科、蘑菇屬,又名口蘑、洋蘑菇、白蘑菇、圓蘑菇。雙孢菇的野生資源分布于歐洲、北非、北美洲和澳大利亞等地[1]。

        雙孢菇營養(yǎng)價(jià)值高,含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和礦物質(zhì),蛋白質(zhì)含量可達(dá)40%,含有多種氨基酸,其中8種是人體必需氨基酸,賴氨酸和亮氨酸含量豐富,含有豐富的維生素[2-3]。雙孢菇為藥食同源的食用菌,味甘性平,具有降血壓、提神消化的作用。常食用雙孢菇,能預(yù)防壞血病、腫癌,促進(jìn)傷口愈合,并對(duì)肝炎、肝硬化具有輔助療效[4-8]。將雙孢菇的多糖、活性肽、氨基酸等活性成分提取出來可開發(fā)為藥物或保健品。

        雙孢菇菌蓋表面沒有保護(hù)結(jié)構(gòu),不能阻止外界的物理傷害、微生物侵染,加之雙孢菇呼吸速率高及含水量多,使得雙孢菇極易腐爛和褐變[9],不利于雙孢菇生理活性物質(zhì)的提取獲得,而且子實(shí)體的人工栽培周期長,費(fèi)工費(fèi)時(shí)。利用液體深層培養(yǎng)菌絲體具有培養(yǎng)周期短、標(biāo)準(zhǔn)化操作、規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),通過液體發(fā)酵可以快速得到雙孢菇的菌絲體和生理活性物質(zhì),毛勇等[10]研究了碳源、氮源、無機(jī)鹽對(duì)雙孢菇胞外多糖產(chǎn)量的影響,王敏等[11]研究了不同碳氮源對(duì)雙孢菇深層發(fā)酵的影響,目前尚未見有系統(tǒng)研究雙孢菇深層發(fā)酵工藝的報(bào)道。

        本研究通過對(duì)雙孢菇深層發(fā)酵工藝的優(yōu)化,為大規(guī)模發(fā)酵雙孢菇獲取菌絲體和生理活性物質(zhì)提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        菌種 由市售的新鮮雙孢菇子實(shí)體中分離所得,經(jīng)姜寧副教授鑒定為雙孢菇(Agaricus bisporus)。培養(yǎng)基配方 固體斜面種子培養(yǎng)基:馬鈴薯20%,蔗糖2%,瓊脂2%,pH自然。活化培養(yǎng)基:同斜面培養(yǎng)基。液體種子培養(yǎng)基:馬鈴薯20%,葡萄糖1%,麥芽糖 1% ,MgSO40.15% ,K2HPO40.1% ,pH7.0。

        HZQ-F100全溫振蕩培養(yǎng)箱 大倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;SPX-250B生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;SW-CJ-2F潔凈工作臺(tái) 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司;YXQ-LS-30SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;電熱恒溫干燥箱 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 工藝流程 菌種活化→液體種子→液體發(fā)酵→過濾發(fā)酵液,得菌絲體→清洗菌絲體→干燥→稱菌絲干重

        1.2.2 操作步驟 在無菌條件下,用接種鏟從斜面菌種上切取1cm2的菌塊接種至PDA斜面培養(yǎng)基上,26℃恒溫培養(yǎng)6d,挑選菌絲潔白、粗壯、濃密、無污染的斜面作為供試菌種。按上述步驟將斜面種子接至液體種子培養(yǎng)基上,26℃恒溫振蕩培養(yǎng)6d。吸取一定量的液體種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基,26℃、120r/min培養(yǎng)6d。將發(fā)酵醪用4層紗布過濾,并用蒸餾水進(jìn)行反復(fù)沖洗,105℃烘2h,冷卻后稱重,再放入105℃中烘30min再稱重。直至兩次稱重的重量差不超過2mg即為恒重。

        1.2.3 液體培養(yǎng)基優(yōu)化

        1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 以可溶性淀粉3%、黃豆粉3%(煮沸30min,4層紗布過濾取濾液,以下黃豆粉處理相同)、KH2PO40.05% 、MgSO40.05% 為基本培養(yǎng)基,調(diào)整碳源、氮源、無機(jī)鹽和維生素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。如碳源單因素實(shí)驗(yàn)分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、玉米淀粉為碳源;氮源則分別以蛋白胨、酵母膏、麩皮、黃豆粉、尿素、(NH4)2SO4、NaNO3為氮源;無機(jī)鹽單因素實(shí)驗(yàn)分別將 KCl、CaCl2、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、FeSO4作為無機(jī)鹽;而維生素的因素實(shí)驗(yàn)分別將 VB1、VB2、VB6、VB1+VB2、VB1+VB6、VB2+VB6和 VB1+VB2+VB6作為生長因子。以獲得培養(yǎng)雙孢菇菌絲體最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽和維生素。

        1.2.3.2 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子,采用均勻設(shè)計(jì)表,每一因素取8水平。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

        1.2.4 發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化 在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以接種量、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速為實(shí)驗(yàn)因子,以菌絲體干重作為指標(biāo),采用中心復(fù)合設(shè)計(jì),各因子水平及編碼表見表2。

        表1 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of U8uniform design

        表2 實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 2 Factor and coded levels of experiment

        1.3 數(shù)據(jù)分析

        所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,單因素和均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,組間多重比較用最小顯著差異(Least Significant Difference,LSD)法;中心復(fù)合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)用Design Expert 8.0進(jìn)行分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        2.1.1 不同碳源對(duì)菌絲生長的影響 碳源濃度均為3%,碳源篩選實(shí)驗(yàn)的 F 值 =18.927 > F0.01(=4.456),說明不同碳源對(duì)菌絲體產(chǎn)量的作用差異是極顯著的。LSD法進(jìn)行多重比較,結(jié)果見表3。由表3可知可溶性淀粉作為碳源時(shí),菌絲生長量最大,且和其它碳源作用的差異達(dá)極顯著水平,麥芽糖、玉米淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇之間差異不顯著。這是由于雙孢菇為大型真菌,生長周期長,單糖、雙糖代謝過快,不適應(yīng)雙孢菇的生長需要,而多糖類碳源需經(jīng)菌體產(chǎn)生的胞外酶水解成單糖后再被利用,能提供長期營養(yǎng),所以適合雙孢菇的生長需要。

        2.1.2 不同氮源對(duì)菌絲體生長的影響 氮源濃度均為 3%,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,F(xiàn)=119.037 > F0.01(=4.46),說明不同氮源對(duì)菌絲生長量有極顯著差異影響。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較(LSD法),由表4可以得出:雙孢菇對(duì)有機(jī)氮的利用明顯好于無機(jī)氮,其中蛋白胨的菌絲體干重明顯高于其他氮源,而酵母膏、麩皮和黃豆粉之間差異不顯著,(NH4)2SO4、NaNO3和尿素上的菌絲體幾乎不長,之間的差異也不顯著。說明雙孢菇本身不能直接利用無機(jī)氮合成某些氨基酸,需從有機(jī)氮源中攝?。?2]。

        2.1.3 不同無機(jī)鹽對(duì)菌絲體生長的影響 所有無機(jī)鹽加入量均為0.05%,無機(jī)鹽篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果的F=6.997 > F0.01(=5.064),表明不同的無機(jī)鹽會(huì)對(duì)菌絲體生長量產(chǎn)生極顯著影響。采用LSD法進(jìn)行多重比較(表 5),可以看出:KCl、CaCl2、KH2PO4、K2HPO4對(duì)菌絲生物量的影響無顯著差異,MgSO4與FeSO4、KCl之間存在顯著差異,無機(jī)鹽為FeSO4時(shí)菌絲體干重顯著小于其他無機(jī)鹽。下面實(shí)驗(yàn)中選用KCl。

        表3 不同碳源對(duì)菌絲體干重影響差異顯著性比較(LSD法)Table 3 Difference signification of carbon source effect on dry mycelia yield by LSD

        表4 不同氮源對(duì)菌絲體干重影響差異顯著性比較(LSD法)Table 4 Difference signification of nitrogen source effect on dry mycelia yield by LSD

        表5 不同無機(jī)鹽對(duì)菌絲體干重影響差異顯著性比較(LSD法)Table 5 Difference signification of inorganic salt effect on dry mycelia yield by LSD

        表6 不同維生素對(duì)菌絲體干重影響差異顯著性比較(LSD法)Table 6 Difference signification of vitamin effect on dry mycelia yield by LSD

        2.1.4 不同維生素對(duì)菌絲體生長的影響 維生素均加入10mg/100mL,計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果的 F值 =6.031>F0.01(=4.46),即不同維生素對(duì)菌絲體生長影響差異達(dá)極顯著水平,采用LSD法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較(表6),得出VB1對(duì)菌絲體生長最有利,它與其他維生素之間作用差異達(dá)顯著水平,其他維生素之間無顯著差異。

        2.1.5 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 對(duì)均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表7)利用SPSS軟件進(jìn)行回歸處理,得出如下回歸方程

        式中 y 表示菌絲體干重(g/100mL),x1、x2、x3、x4分別表示可溶性淀粉、蛋白胨、KCl、VB1的濃度。

        R=0.995,R2=0.990,F(xiàn)=72.704 > F0.01(4,3)=28.71,P=0.003,說明建立的回歸方程具有顯著的線性關(guān)系。對(duì)各因素的偏回歸系數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)(表8),可以得知四個(gè)因素對(duì)菌絲體產(chǎn)量存在著顯著影響,主次順序?yàn)?/x1>x2>x4>x3。

        根據(jù)回歸方程:菌絲體產(chǎn)量與可溶性淀粉的含量倒數(shù)呈負(fù)相關(guān),與蛋白胨、VB1的濃度呈正相關(guān),與KCl濃度呈負(fù)相關(guān),所以,可溶性淀粉的濃度取實(shí)驗(yàn)濃度的上限即4.6%,蛋白胨取上限4.6%,KCl取下限0.02%,VB1取上限 18mg/100mL,將上述數(shù)據(jù)代入方程中,得出理論菌絲體干重為2.561g/100mL。

        雙孢菇的菌絲體產(chǎn)量與1/x1成一定的比例關(guān)系,如設(shè)A=x2/x1(即氮碳比),上述線性方程可換算成:

        這就直接證明了微生物生長量不僅與氮源、碳源含量有關(guān),而且與它們的比值相關(guān),在研究白靈菇深層發(fā)酵也發(fā)現(xiàn)了相同的規(guī)律[13]。

        采用優(yōu)化的培養(yǎng)基配方進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),所得菌絲體干重平均達(dá)2.602g/100mL,與預(yù)測(cè)值相符,優(yōu)于均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的所有組合實(shí)驗(yàn)值。

        表7 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of uniform design experiment

        表8 各偏回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 8 Significance test of partial regression coefficients

        2.2 中心復(fù)合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

        2.2.1 回歸模型的建立 運(yùn)用 Design Expert 8.0對(duì)中心復(fù)合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表9)進(jìn)行分析,得出的回歸方程如下:

        Y=3.052+0.085X1+0.168X2+0.086X3+0.047X1X2+0.036X1X3+0.137X2X3-0.132X12-0.351X22-0.146X32

        其中 R2=0.960,F(xiàn)=26.56,p <0.0001,極顯著;失擬性實(shí)驗(yàn) F=1.02,p 值為 0.49,不顯著,證明所建的回歸方程擬合得很好。

        2.2.2 各因子主次關(guān)系 方差分析結(jié)果(表10)表明:除X1X2,X1X3項(xiàng)外其余各項(xiàng)作用均達(dá)顯著水平,根據(jù)回歸方程中偏回歸系數(shù)絕對(duì)值大小和F值,可以得到各因子和交互作用的主次順序?yàn)?X22>X2>X32>X2X3>X12>X3>X1>X1X2>X1X3。

        由于X1X2,X1X3項(xiàng)作用不顯著,所以需將上述回歸方程中這二項(xiàng)刪除。

        2.2.3 各因子組合的優(yōu)化 根據(jù)已刪除不顯著項(xiàng)的回歸方程,計(jì)算出 X1=0.32、X2=0.33、X3=0.45,將各因子的編碼值換算成自然變量,即接種量11%、發(fā)酵溫度26℃、轉(zhuǎn)速 143r/min時(shí),Y達(dá)最高值 3.113g/100mL。對(duì)優(yōu)化的工藝進(jìn)行驗(yàn)證,得出菌絲體干重達(dá)3.125g/100mL,說明得出的最佳工藝有很好的實(shí)用性。

        2.2.4 響應(yīng)面分析 圖1為響應(yīng)面分析圖,從中可以直觀看出各因子對(duì)響應(yīng)值影響的變化趨勢(shì)。圖1A為當(dāng)轉(zhuǎn)速為143r/min時(shí),隨著接種量的加大和發(fā)酵溫度的上升,菌絲體產(chǎn)量逐步提高,當(dāng)達(dá)到一定水平時(shí),產(chǎn)量不再上升,反而會(huì)下降;當(dāng)發(fā)酵溫度為26℃時(shí),接種量和轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲體干重的影響如圖1B所示,在接種量和轉(zhuǎn)速在最優(yōu)水平以下時(shí),菌絲體干重隨因子數(shù)值的增加而增加,到達(dá)最優(yōu)水平以后,響應(yīng)值下降。當(dāng)接種量為11%時(shí),發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)響應(yīng)值的影響與以上分析相同(圖1C)。

        圖1 雙孢菇液體發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面分析Fig.1 Response surface analysis of optimization of liquid fermentation for Agaricus bisporus

        3 結(jié)論

        通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選出雙孢菇的最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽和維生素分別為可溶性淀粉、蛋白胨、KCl和VB1。通過均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)確定了雙孢菇深層發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基配方為:可溶性淀粉4.6%、蛋白胨4.6%、KCl 0.02%,VB118mg/100mL,理論預(yù)計(jì)值為2.561g/100mL,這一結(jié)論得到驗(yàn)證。中心復(fù)合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明雙孢菇溶層發(fā)酵的最佳工藝是:接種量11%、發(fā)酵溫度26℃、轉(zhuǎn)速143r/min時(shí),此時(shí)菌絲體干重達(dá)3.112g/100mL。驗(yàn)證結(jié)果顯示菌絲體干重達(dá)3.125g/100mL,與未優(yōu)化的配方和工藝相比,產(chǎn)量提高了202%,說明得出的最佳工藝有很好的實(shí)用性。

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