王新紅，王京平，朱 瑋

(江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鹽城師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，江蘇鹽城224051)

堿蓬(SuaedaglaucaBge)是蔾科(Chenopodiaceae)堿蓬屬(Suaeda)植物［1］，常稱為“海英菜”、“堿蒿”、“鹽蒿”，是典型鹽生植物［2］。堿蓬的鮮嫩莖葉營(yíng)養(yǎng)豐富，籽粒的脂肪含量高達(dá)36.4%，遠(yuǎn)高于大豆(18.8%)［3］。另外，堿蓬的莖葉中含有大量的人體所必需的氨基酸、維生素、胡蘿卜素和 Cu、Zn、Ca、Fe、Mn、P、Se 等微量元素［3-4］，其中有許多指標(biāo)都高于螺旋藻。此外也可做動(dòng)物飼料［5］，可做肥皂、油漆，可用于印染、玻璃工業(yè)等［6］，是化學(xué)工業(yè)的原料。綜上可見，在食用、保健、藥用方面，堿蓬的研究和開發(fā)價(jià)值很大，由此也引起了許多學(xué)者的關(guān)注［7-9］，經(jīng) SCI和 EI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，及國(guó)內(nèi) CNKI檢索結(jié)果發(fā)現(xiàn)，涉及堿蓬的相關(guān)研究主要是堿蓬中的黃酮類物質(zhì)［7］、蛋白［8］、甜菜紅素［9］、多糖［10］等的提取研究，但未見有對(duì)堿蓬中總酚的提取及工藝優(yōu)化方面的相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過超聲提取的方法從堿蓬籽中提取總酚［11］，研究在不同的溫度、不同的提取時(shí)間、不同的料液比及不同的乙醇的體積分?jǐn)?shù)下的總酚的含量(total phenolic content，TPC)，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化［12］并確定最佳工藝參數(shù)，獲得回歸模型，并驗(yàn)證。為堿蓬在食品、醫(yī)藥、化學(xué)工業(yè)等行業(yè)的進(jìn)一步分析、開發(fā)及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

福林酚試劑、沒食子酸、無水乙醇、碳酸鈉 上海國(guó)藥集團(tuán);其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。堿蓬籽于2012年10月在鹽城大豐海堤采摘，清洗后在60℃下烘干至恒重，粉碎后過60目篩，密封放置4℃的條件下待用。

SPECORD-50紫外分光光度計(jì) 德國(guó)耶拿公司;KQ-300E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;SHB-IIIT循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及總酚的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［12］的方法，稍作修改:精確稱取0.100g沒食子酸，加蒸餾水定容至100mL，分別移出 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL 至100mL 容量瓶，濃度為 0、10、20、30、40、50、60、70μg/mL沒食子酸溶液。再取1mL各濃度沒食子酸溶液，加入1mL福林酚試劑(1∶1)，然后加入3mL 7.5%碳酸鈉溶液，在 25℃下反應(yīng) 30min，在765nm下測(cè)定吸光度值。以吸光度A和沒食子酸溶液濃度進(jìn)行線性擬合，得線性回歸方程:y=0.019x+0.1707，R2=0.9912，其中 x 是食子濃度(μg/mL)，y值是吸光度A。與上述方法同，測(cè)定不同工藝得到的堿蓬籽提取液的吸光度A，總酚的提取量則可根據(jù)下式進(jìn)行計(jì)算:TPC(μg/g)=(A-0.1707)(料液的體積(mL)/［0.019(堿蓬樣品的質(zhì)量(g)］。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇 準(zhǔn)確稱取1.000g研磨后的堿蓬籽置于25mL容量瓶中，按料液比1∶20，分別加入濃度為30%、50%、70%、90%、100%的乙醇20mL，提取2次，每次取一半體積的溶劑提取，兩次提取液合并后離心，取出上層清液1mL，測(cè)定溶液中總酚的含量，從而選擇總酚含量最高的乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行后序?qū)嶒?yàn)。

1.2.2.2 提取時(shí)間的選擇 按料液比1∶20加入90%的乙醇，在 40℃超聲儀中分別浸提 0.5、1.0、1.5、2.0h，提取2次，每次取一半體積的溶劑提取，兩次提取液合并后離心，取上層清液1mL，測(cè)定溶液中總酚的含量，從而選擇最佳的提取時(shí)間。

1.2.2.3 提取溫度的選擇 按料液比1∶20加入90%的乙醇，分別在 20、40、60、80℃超聲儀中浸提 30min，提取2次，每次取一半體積的溶劑提取，兩次提取液合并后離心，取上層清液1mL，測(cè)定溶液中總酚的含量，從而選擇最佳的提取溫度。

1.2.2.4 料液比的選擇 原料按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 加入 90%乙醇，在 80℃ 條件下浸提 1h，提取次數(shù)為2次，合并兩次提取液，離心后，取上層清液，測(cè)定溶液中總酚的含量，從而選擇最佳的料液比。

1.2.3 響應(yīng)面分析 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取依照響應(yīng)面分析法中的Box-Behnken Design中心組合法設(shè)計(jì)并優(yōu)化提取工藝。以總酚提取量為響應(yīng)值，4因素3水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理均采用Design Expert7.1.6軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法1.2.2中的單因素實(shí)驗(yàn)方法研究不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)堿蓬中總酚提取量的影響實(shí)驗(yàn)，在40℃的溫度下，時(shí)間為30min，料液比為1∶20的提取條件下，結(jié)果如圖1。由圖1可見，堿蓬中的總酚的提取量隨著乙醇濃度的升高而增加，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到90%，總酚的提取量達(dá)到此時(shí)提取條件下的最大值，這是由于有機(jī)溶劑乙醇量的增加抑制了多酚與植物基質(zhì)中其他組分的反應(yīng)而提高了多酚的溶出率，繼續(xù)升高乙醇濃度，總酚提取量增長(zhǎng)的幅度下降。這可能與溶劑中乙醇量加大，而水含量減小引起了水溶性的酚類物質(zhì)的溶出率減小有關(guān)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇乙醇的體積分?jǐn)?shù)為80%、90%、100%進(jìn)行優(yōu)化分析［13］。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Experimental factors and levels using RSM

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總酚提取量的影響Fig.1 Effect of volume fraction of ethanol on TPC

2.1.2 提取時(shí)間 在料液比固定為1∶20，加入90%的乙醇溶劑，溫度設(shè)定40℃，提取時(shí)間分別為20、40、60、80min時(shí)，研究堿蓬提取液中總酚的含量與時(shí)間的影響關(guān)系，結(jié)果見圖2。如圖2所示，當(dāng)提取時(shí)間逐漸增加時(shí)，總酚的提取量隨時(shí)間的增加而增加，達(dá)到60min后，總酚的提取量達(dá)到最大值，60min后，總酚的提取量開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能由于隨著時(shí)間的增加，堿蓬籽中總酚提取量增大到了實(shí)驗(yàn)條件下的最大溶出值，而之后總酚的提取量顯示下降，可能是提取時(shí)間的增加也引起堿蓬細(xì)胞基質(zhì)中其他組分的溶出增加，從而溶劑的粘度增加，溶質(zhì)多酚的輸出速率受到阻礙而減小的緣故。因此選擇提取時(shí)間為40、60、80min 進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.3 提取溫度的選擇 以料液比1∶20加入90%的乙醇，提取時(shí)間設(shè)定60min，研究溫度分別為20、40、60、80、85℃時(shí)堿蓬中總酚提取量的影響，結(jié)果見圖3。當(dāng)提取溫度到60℃時(shí)，總酚的提取量還在增加，到80℃時(shí)，提取量增加幅度逐漸減緩，甚至到85℃時(shí)，提取量開始有下降趨勢(shì)，原因可能與總酚物質(zhì)在高于80℃后會(huì)破壞其結(jié)構(gòu)而發(fā)生降解有關(guān)，所以實(shí)驗(yàn)選擇40、60、80℃為后序優(yōu)化溫度。

圖2 時(shí)間對(duì)總酚提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on TPC

圖3 溫度對(duì)總酚提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on TPC

2.1.4 料液比 原料按料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40g/mL 時(shí)加入 90%乙醇，在 80℃ 條件下浸提60min，測(cè)定溶液中總酚的含量，結(jié)果如圖4。當(dāng)料液比逐漸增加時(shí)，多酚的提取量逐漸增加，隨后隨著溶劑量的增加，總酚提取量又出現(xiàn)下降，這可能是因?yàn)槿軇┝康脑黾?，致使多酚與空氣的接觸機(jī)會(huì)增加，加速了多酚的氧化，所以提取量反而減小。從節(jié)約溶劑的角度考慮，選擇料液比為1∶20。

圖4 料液比對(duì)總酚提取量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on TPC

2.2 提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及模型 依照表1中的設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)值的實(shí)驗(yàn)值見表2。

利用Design Expert軟件對(duì)表1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到三次方的回歸模型為:

2.2.2 驗(yàn)證結(jié)果 通過Design-Expert軟件，得出最優(yōu)提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，時(shí)間為80min，溫度為80℃，料液比為23.42g/mL，理論最大提取率為996.94μg/g。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)把料液比修正為23g/mL，測(cè)定三次實(shí)驗(yàn)的提取量分別為 997.62、989.81、970.66μg/g，平均值為 986.03μg/g，RSD%=1.41，這說明該方程與實(shí)際情況符合得較好，該軟件的優(yōu)化條件合理。

表2 響應(yīng)面結(jié)果表Table 2 Results of response surface methodology

3 結(jié)論

測(cè)定堿蓬籽中總酚含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)中的四個(gè)影響因素除外，超聲儀的功率也是主要因素之一。另外，文中得出的最優(yōu)工藝參數(shù)中，溫度80℃已經(jīng)達(dá)到了儀器設(shè)定溫度的上限，在優(yōu)化工藝條件下得到多酚量的預(yù)測(cè)值可能也不是最佳值。但實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以作為堿蓬多酚提取工藝的基本參考數(shù)據(jù)。目前對(duì)于天然植物中的總酚的提取方法應(yīng)用廣泛的還有微波輔助提取法，都優(yōu)于傳統(tǒng)的熱回流法、索氏提取、浸取法等。另外提取溶劑的選擇應(yīng)該朝向綠色化、環(huán)保型發(fā)展，離子液體是目前發(fā)展前景極好的選擇。對(duì)于這部分研究目前本工作室正在進(jìn)行中。期望對(duì)于濕地、耐鹽、耐寒、及具有多種活性，且在食品、醫(yī)藥、工業(yè)應(yīng)用廣泛的植物——堿蓬的研究提供可用的信息。

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 Results of regression model and analysis of variance

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