丁 健，高敏杰，侯國力，梁克學，史仲平，*，于瑞嵩，李 震

(1．江南大學生物工程學院，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122;2．上海農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106)

畢赤酵母表達系統(tǒng)是一類應用廣泛的真核表達系統(tǒng)，因其具有表達效率高、外源基因遺傳穩(wěn)定、易實現高密度培養(yǎng)、產物可分泌和蛋白翻譯后加工等眾多其它表達載體所無法比擬的優(yōu)點，受到越來越多的重視和應用［1-2］。重組畢赤酵母發(fā)酵生產外源蛋白的發(fā)酵過程，主要包括前期的細胞培養(yǎng)以及后期的甲醇誘導兩個階段。在細胞培養(yǎng)階段，通常以甘油作為碳源，促使菌體大量增殖。經過30～35h的培養(yǎng)，細胞可達到130～150g-DCW/L的較高濃度。在誘導階段，向發(fā)酵體系中添加誘導劑甲醇，誘導外源蛋白的表達［3］。近年來，細胞培養(yǎng)階段的研究工作主要集中于通過優(yōu)化甘油流加工藝，提高細胞的比生長速率，為后期的誘導表達過程提供盡可能多的菌體［4］。然而，在相同的誘導條件下，影響目的蛋白表達水平的主要因素并非只有細胞濃度，細胞的生理活性與功能同樣重要。本研究室在前期工作中發(fā)現，畢赤酵母發(fā)酵細胞培養(yǎng)階段末期甘油過量添加會導致乙醇大量積累，并且提出了改良型的DO-Stat甘油流加策略，有效抑制乙醇的積累，提高了豬α干擾素的表達水平［5］。在前期研究的基礎上，本研究進一步探討了甘油流加末期長時間的高乙醇濃度環(huán)境以及短時間內高乙醇濃度沖擊對目的蛋白表達水平以及碳源代謝途徑中關鍵酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇利用慢型菌株Pichia pastoris KM71H。由上海農業(yè)科學院畜牧所構建，載體為pPICZa。

平板培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，營養(yǎng)瓊脂2．5%;種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10;罐發(fā)酵初始培養(yǎng)基(g/L):甘油 20，MgSO41，K2SO41，(NH4)2SO45，CaSO40．1，H3PO42(%，v/v)，PTM110(mL/L)，pH6．0;甘油流加培養(yǎng)基(g/L):甘油 500，(NH4)2SO40．5，KH2PO40．5，MgSO40．03，PTM110(mL/L);甲醇誘導培養(yǎng)基:甲醇500，(NH4)2SO40．5，KH2PO40．5，MgSO40．03，PTM110(mL/L);山梨醇(共混)流加培養(yǎng)基(g/L):山梨醇500。

BIOTECH-2002 5L發(fā)酵罐 上海保興生物設備工程有限公司;pH和 DO電極 梅特勒公司;LKM2000A尾氣分析儀 韓國LOKAS公司;小型垂直電泳儀 美國Bio-Rad公司;G:Box生物成像系統(tǒng)和Gene Tools軟件 英國SynGene公司;FC-2002甲醇電極流加控制器 華東理工大學研制;GC112A氣相色譜儀 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與豬α干擾素的誘導表達

1．2．1 高密度細胞流加培養(yǎng)方法 細胞培養(yǎng)在5L發(fā)酵罐內進行。初始裝液量1．5L，接種量20%，通氣速度4vvm，溫度30℃。使用25%的氨水將pH自動控制于6．0，調節(jié)攪拌轉速將溶氧濃度(Dissolved oxygen，DO)維持在10%以上。甘油耗盡時DO迅速上升，啟動文獻中報道的改良型DO-Stat控制程序［5］、流加甘油培養(yǎng)基?？諝夤┭鯚o法控制DO時，使用純氧供氧。甘油流加末期(誘導前16h)，按照實驗設計的要求在不同的實驗批次中，分別采用三種乙醇控制模式:批次1和批次2中使用改良型DO-Stat甘油流加控制程序［5］，乙醇濃度的控制水平設定為2g/L，始終將乙醇控制在較低濃度;批次3和批次4中，在誘導前8h人為添加乙醇，將發(fā)酵液中的乙醇濃度迅速提高至10g/L以上的較高濃度，之后繼續(xù)采用改良型DO-Stat控制過程控制甘油流加，將乙醇濃度維持在10g/L以上，持續(xù)4～5h;批次5中，在誘導前12h人為添加乙醇，將乙醇濃度迅速提高至12g/L以上，之后停止流加甘油，菌體開始利用乙醇。直至誘導前9．5h，乙醇自然耗盡，繼續(xù)采用改良型DO-Stat控制程序將乙醇濃度控制在低水平。細胞濃度達到“高密度”要求(130～150g-DCW/L)后，停止甘油流加、進行1～2h的“饑餓培養(yǎng)”，直到發(fā)酵液中的甘油和其它有可能充當替代碳源的中間代謝物質全部消耗殆盡后開始誘導。

1．2．2 豬α干擾素誘導表達方法 根據甲醇電極讀數手動調節(jié)甲醇誘導培養(yǎng)基的流加速度，將甲醇濃度控制于約5g/L的水平。同時，按照1∶1的體積比加入山梨醇流加培養(yǎng)基。誘導期全程通空氣供氧、通氣速度 4vvm，pH5．5，溫度 30℃。

1.3 分析方法

1．3．1 菌濃測定 測量方法與參考文獻［6］相同。

1．3．2 乙醇和甲醇濃度的離線測定 測量方法與參考文獻［7］相同。

1．3．3 攝氧速率(Oxygen uptake rate，OUR)的測定 測量方法與參考文獻［8］相同。

1．3．4 總蛋白以及豬α干擾素濃度測定 發(fā)酵液中的總蛋白濃度采用考馬斯亮藍比色法測定［9］。使用軟件分析SDS-PAGE凝膠圖像，計算得到豬α干擾素濃度。

1．3．5 碳源(甘油、甲醇)代謝關鍵酶活性的測定 破壁方法:取1mL發(fā)酵液加水定容至10mL，10000r/min離心20min后收集菌體。加入10mL含有蝸牛酶的pH7．5的磷酸緩沖液將菌體懸浮，0℃超聲破碎90次(運行5s間隔5s，功率400W)。最后，10000r/min離心20min，上清液即為無細胞酶液。甲醇代謝途徑中的關鍵酶包括:醇氧化酶(AOX)、甲醛脫氫酶(FLD)、甲酸脫氫酶(FDH);甘油代謝途徑中的關鍵酶為甘油激酶(GK)。上述各酶比活性按照文獻中報道的方法測定［10-12］。

1．3．6 基因轉錄水平測定 本研究所用菌株中，AOX由aox2基因編碼。提取RNA，采用RT-PCR與實時定量PCR方法測定aox2基因轉錄水平。測定工作委托上?？党缮锕こ逃邢薰就瓿伞?/p>

2 結果與分析

2.1 細胞培養(yǎng)末期高乙醇濃度對豬α干擾素表達水平的影響

批次1～批次4誘導前16h內的乙醇控制水平如圖1A所示。批次1和批次2的乙醇濃度始終低于2g/L;批次3中，在誘導前7～3h，乙醇濃度始終維持在10g/L左右;批次4中，誘導前8～3h，乙醇濃度始終維持在12～15g/L之間。當菌體濃度達到130～150g/L時，停止流加甘油。經過短暫的饑餓培養(yǎng)，待發(fā)酵液中以及細胞內部殘留的乙醇以及其它可以作為替代碳源的中間代謝產物完全耗盡后，流加甲醇誘導培養(yǎng)基開始誘導豬α干擾素表達。

圖1 誘導前16h內乙醇濃度Fig．1 Ethanol concentrations in 16 h before induction

在誘導的起始階段，菌體需要約5～8h的時間，用來合成甲醇代謝途徑中的各個關鍵酶，以適應代謝甲醇的需求。在這一段適應期內，細胞活性很低，主要表現為OUR不斷降低或者始終維持在較低水平。如圖2所示，在批次1和批次2誘導起始的5～8h內，OUR始終維持在較低水平，約40mmol/(L·h)。之后OUR開始穩(wěn)步上升，在誘導20h時達到約140mmol/(L·h)，一直維持至誘導結束(70h)，同時甲醇消耗速率分別達到 3．42g/(L·h)和 3．23g/(L·h)。在批次 3 起始誘導的前8h內 OUR略有提高，之后始終維持于80mmol/(L·h)的水平。直至誘導20h，OUR未見明顯提高，且甲醇消耗速度極低，僅為0．84g/(L·h)(圖3)，發(fā)酵被迫停止。在批次4起始誘導的前20h內，OUR由起始的 80～90mmol/(L·h)穩(wěn)步下降至20mmol/(L·h)以下，同時甲醇消耗速度下降至0．28g/(L·h)(圖 3)，于20h 時結束發(fā)酵。

圖2 誘導期OUR變化Fig．2 OUR in the whole induction phase

圖3 誘導20h時甲醇消耗速率Fig．3 Methanol consumption rate at 20h of induction

圖4中比較了5個批次誘導階段發(fā)酵液中總蛋白濃度的變化情況:批次1和批次2的最高總蛋白濃度分別達到5．51g/L和4．71g/L;提前結束的批次3和批次4，在發(fā)酵結束時的總蛋白濃度分別達到0．84g/L和 0．63g/L。選取各批次發(fā)酵結束時的樣品，使用SDS-PAGE測定其中的目標蛋白濃度，結果如圖5所示。使用圖像分析軟件，分析得到批次1～批次 5 的豬 α 干擾素最終濃度分別為:3．65、3．08、0．75、0．20 和 0．42g/L。由此可見，生長末期的低乙醇濃度有利于誘導階段細胞生理活性的恢復以及目的蛋白的高效表達。相反地，生長末期的高乙醇濃度，會導致菌體在誘導階段無法恢復生理活性，最終導致發(fā)酵的失敗。雖然，經過誘導前的饑餓培養(yǎng)后，乙醇已經完全耗盡，但是高乙醇濃度對外源蛋白表達的抑制作用是不可逆的，不會隨著乙醇的耗盡而消除。

2.2 細胞培養(yǎng)末期高乙醇濃度對碳源代謝關鍵酶活性的影響

圖4 誘導期總蛋白變化Fig．4 Total protein concentration in induction phase

圖5 發(fā)酵最終樣品SDS-PAGE檢驗結果Fig．5 Results of SDS-PAGE of final samples

由前期報導可知，重組畢赤酵母發(fā)酵過程中，乙醇積累主要出現在甘油流加末期［5］，而在此階段，細胞的比生長速率與碳源甘油的消耗密切相關。因此，乙醇積累是否會影響甘油的正常利用是關鍵問題。以批次2和批次4為例，比較了低乙醇濃度和高乙醇濃度環(huán)境下甘油代謝關鍵酶GK的比活性。比較結果如圖6A所示，批次2誘導前4h GK的比活性達到1．84U/g-DCW，而批次4誘導前4h GK的比活性遠遠低于批次2，僅達到批次2的12．5%。由此可以推斷，甘油流加末期乙醇的大量積累，會大幅度降低菌體代謝甘油的速度。

從圖1A和圖3中可以看出，甘油流加末期的高乙醇濃度會降低誘導階段甲醇的消耗速率。即使乙醇在誘導前已經被耗盡，它對誘導期的影響仍然無法消除，這可能是由于乙醇影響了功能性細胞骨架的生成、破壞了細胞的正常結構而造成的。在圖6B～D中，以批次2和批次4為例，進一步比較了整個誘導階段甲醇代謝途徑中關鍵酶AOX、FLD以及FDH的比活性。從圖中可知，批次2誘導階段AOX、FLD以及FDH三種酶的比活性均遠遠高于批次4，達到批次4的數十倍。外源蛋白誘導表達的過程中，甲醇既作為誘導劑，同時又為蛋白合成的過程提供碳源和能量。批次4中，甘油流加階段末期的高乙醇濃度大大降低了誘導階段甲醇代謝途徑中各個關鍵酶的比活性，使得細胞甲醇代謝途徑受阻，減少了對蛋白合成途徑碳源和能源的供應。蛋白合成途徑無法正常運轉，最終導致發(fā)酵過程提前結束，最終的目的蛋白產量僅達到批次2的6．5%。

圖6 甘油以及甲醇代謝關鍵酶比活性Fig．6 Specific activities of enzymes in glycerol and methanol metabolism

在甲醇代謝的關鍵酶中，AOX最為重要，它催化甲醇代謝途徑中的第一步反應，直接影響菌體利用甲醇的能力。本研究中所用菌株為Muts型畢赤酵母，因此AOX由aox2基因編碼。批次1～4中，誘導20h時菌體aox2基因的轉錄水平如圖7所示。批次2最高，達到14．4，分別是批次3和批次 4的 17．1倍和25．7倍。由此可知，誘導階段末期的高乙醇濃度會抑制誘導期aox2基因的轉錄，從而降低菌體內部AOX比活性，影響甲醇的正常利用，最終降低目的蛋白的表達水平。

2.3 高乙醇濃度的短期沖擊對發(fā)酵性能及酶活的影響

圖7 aox2基因轉錄水平Fig．7 Transcriptional level of aox2 gene

如圖2所示，批次5誘導前20h內，OUR由48mmol/(L·h)降低至 15mmol/(L·h)。并且，在誘導20h時，甲醇消耗速度僅有0．16g/(L·h)(圖 3)，甲醇消耗幾乎停止，發(fā)酵實驗被迫終止。如圖4所示，誘導期內發(fā)酵液中最高總蛋白濃度達到1．9g/L，遠遠高于批次3和批次4，與批次1和批次2同一時刻的總蛋白濃度相近。但是，使用SDS-PAGE測定該樣品后發(fā)現，發(fā)酵液中有大量雜蛋白存在，豬α干擾素濃度只達到0．42g/L(圖5)。從圖6A中可以看出，批次5誘導前4h GK比活性為1．01U/g-DCW，高于批次4，但是低于批次2。同樣地，批次5誘導期內AOX、FLD以及FDH比活性也高于批次4和批次5，低于批次1和批次2(圖6B、6C、6D)。最后，從圖7中可以看出，誘導20h時批次5的aox2基因轉錄水平雖然高于批次4，但是仍然處于較低水平。由此可以得出結論，高乙醇濃度沖擊對發(fā)酵性能以及各關鍵酶比活性的破壞作用會隨著持續(xù)時間的延長而增加。但是，即使是極短時間的高乙醇濃度沖擊，仍然會導致發(fā)酵過程的失敗。因此，在重組畢赤酵母發(fā)酵生產外源蛋白的過程中，必須避免細胞培養(yǎng)末期的乙醇積累。

3 結論

本論文研究了畢赤酵母發(fā)酵細胞培養(yǎng)末期乙醇積累對豬α干擾素表達性能以及碳源代謝關鍵酶比活性的影響。結果表明，低乙醇濃度對豬α干擾素的表達最有利，豬 α干擾素最高濃度可以達到3．65g/L。而10g/L以上的高乙醇濃度，不論持續(xù)時間長短，均會大幅度抑制甘油和甲醇代謝關鍵酶的活性，使得豬α干擾素濃度始終維持在0．20～0．75g/L的低水平。

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