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        大豆酯酶的篩選及對有機(jī)磷農(nóng)藥檢測效果的研究

        2014-12-15 02:46:04邵佳甲
        關(guān)鍵詞:甲胺磷敵百蟲酯酶

        邵佳甲

        (長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院,吉林 長春130118)

        目前,全球范圍內(nèi)農(nóng)藥污染廣泛,人們對農(nóng)藥殘留的檢測技術(shù)提出了更高要求,需要快速、可靠、靈敏的農(nóng)藥檢測技術(shù)來進(jìn)行日常監(jiān)測。在眾多快速檢測方法之中,應(yīng)用最為廣泛的為以乙酰膽堿酯酶做酶源做成的試紙條進(jìn)行檢測。但乙酰膽堿酯酶屬于動(dòng)物酯酶,動(dòng)物酯酶不容易取材,且保存困難[1],同時(shí)價(jià)格昂貴。然而植物酯酶與動(dòng)物酯酶存在相似的敏感性[2],并且取材廣泛,價(jià)格低廉,且保存期較長,有較高的研究價(jià)值。[3]

        本文選擇大豆作為研究對象,大豆與其他品種相比酯酶含量較高。[4]但不同品種的大豆酯酶含量不同,因此本文篩選出酯酶含量較高的品種并建立了大豆酯酶和8 種有機(jī)磷農(nóng)藥的線性關(guān)系,確定了最低檢測限。

        一、材料與方法

        1.供試材料

        大豆:26 種大豆購自于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)種子中心。

        主要試劑:市售樂果農(nóng)藥,市售敵百蟲農(nóng)藥,市售敵敵畏農(nóng)藥,市售氧樂果農(nóng)藥,市售久效磷農(nóng)藥,市售甲胺磷農(nóng)藥,市售二嗪磷農(nóng)藥,市售對硫磷農(nóng)藥。

        試劑:無水乙醇(分析純),磷酸二氫鈉,a-乙酸萘酯,磷酸氫二鈉,固藍(lán)B 鹽。

        儀器:722分光光度計(jì)(上海奧普博儀器有限公司);磁力攪拌器(金壇市富華儀器有限公司);離心機(jī)(Sigma公司);恒溫水?。ū本﹪A醫(yī)療器械廠);多功能粉碎機(jī)(天津市泰斯特有限公司)。

        2.試驗(yàn)方法

        (1)制備大豆酯酶:把大豆用多功能粉碎機(jī)粉碎碎,用0.3 mol L 1 pH=7.0 的磷酸緩沖液作提取液,取粉碎后的大豆粉浸泡在磷酸緩沖液中,按質(zhì)量比1∶5 進(jìn)行混合,用磁力攪拌器進(jìn)行30min 攪拌提取,放置4℃冰箱中提取12 小時(shí),然后將溶液離心10min(5000r/min),取上清液便是大豆酯酶粗酶液。[5]

        (2)底物溶液的制備:把100mg a 乙酸萘酯溶解于無水乙醇80mL 中。

        (3)制備顯色試劑:取100mL 蒸餾水,將25mg 固藍(lán)B 鹽溶于其中。

        (4)大豆酯酶含量的測定:在各試管里分別加入制備好的酶液0.1ml,以及pH值為7.5的磷酸緩沖液1.9mL,底物0.1mL,振蕩混勻,然后將試管放置在30℃恒溫水浴鍋中保溫10min,10min 后馬上取出,將0.9mL 顯色劑添加溶液定容至10mL,將此溶液放置在30℃水浴鍋中,進(jìn)行保溫10min,然后在722 分光光度計(jì)下于520nm進(jìn)行測定。

        (5)抑制方程的建立:配制濃度分別為100mg/L、10mg/L、5mg/L、lmg/L、0.5mg/L、0.1mg/L、0.05mg/L、0.01mg/L、0.001mg/L 的有機(jī)磷農(nóng)藥。同時(shí)替換步驟1.2.4 中的磷酸緩沖液,將緩沖液換為不同濃度的農(nóng)藥,然后按(4)的步驟測定吸光值。

        (6)對不同農(nóng)藥檢測限的確定:以儀器可以檢測到的最小農(nóng)藥濃度作為大豆酯酶對農(nóng)藥的最低檢測限。

        二、結(jié)果與分析

        1.比較不同品種大豆酯酶的吸光值

        選取26 種吉林省常見大豆品種按以上步驟處理,測定相應(yīng)的吸光值,吸光值越大,酶活性越高。[6]吸光度比較見表1。對表1 中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得出不同品種大豆總酯酶含量也不相同。

        表1 不同品種大豆酯酶的吸光值比較

        適合農(nóng)藥檢測的,總酯酶含量較高的品種為:通農(nóng)10、吉林36,長農(nóng)16,吉農(nóng)14,吉農(nóng)6,吉農(nóng)16 等。對于這些品種可以對其進(jìn)行進(jìn)一步研究。不適合進(jìn)行農(nóng)藥檢測的品種,總酯酶含量則較低的分別是:吉豐1,吉林35,吉林50,吉林78 等。根據(jù)以上數(shù)據(jù)選擇通農(nóng)10 進(jìn)行有機(jī)磷類農(nóng)藥檢測使用,從而進(jìn)一步研究有機(jī)磷類農(nóng)藥和大豆酯酶之間的作用關(guān)系。

        2.不同濃度農(nóng)藥對大豆酯酶的抑制效果比較

        將敵敵畏、敵百蟲、甲胺磷、二嗪磷、對硫磷、毒死蜱、辛硫磷分別稀釋至以下幾種濃度100mg/L,10 mg/L,5 mg/L,1 mg/L,0.5 mg/L,0.1 mg/L,0.05 mg/L,0.01 mg/L.

        然后按照上面所敘述方法進(jìn)行吸光值測定,通過計(jì)算數(shù)據(jù)計(jì)算農(nóng)藥對酶的抑制率,制作有機(jī)磷農(nóng)藥濃度對數(shù)與抑制率之間的對數(shù)曲線(如圖1),對數(shù)方程的斜率能反映出大豆酯酶對有機(jī)磷農(nóng)藥的靈敏度。

        對圖表進(jìn)行分析得出,大豆酯酶對不同農(nóng)藥的靈敏度不同,靈敏度高低依次為久效磷,甲胺磷,對硫磷、敵敵畏、敵百蟲、二嗪磷、氧樂果,其中毒死蜱的靈敏度最差。

        圖1 不同農(nóng)藥的抑制曲線

        3.有機(jī)磷農(nóng)藥的抑制反應(yīng)方程和檢測限

        抑制率I=A 未抑制 A 抑制/A 未抑制×100%

        以抑制率I 為X 軸,抑制劑濃度的對數(shù)值為Y 軸,可以用數(shù)值方法擬合出一條抑制率與農(nóng)藥濃度對數(shù)值的抑制方程。從方程中我們能更加直觀地分析出幾種農(nóng)藥和大豆酯酶之間的抑制關(guān)系,而抑制曲線的斜率有效地展示了有機(jī)磷農(nóng)藥對所用大豆酯酶的抑制程度[7],斜率越大對大豆酯酶的抑制率越強(qiáng),靈敏度越高。

        農(nóng)藥曲線方程相關(guān)系數(shù)最低檢測限(ppm)Pesticideequationscoefficient correlationlimit of detection:

        久效磷y=22.505x+37.595R2=0.9860.05 Monocrotophos,甲胺磷y=20.181x+35.644R2=0.9940.05Acephatemet,對硫磷 y = 16.389x + 28.478R2 = 0.99440.05Parathion,敵敵畏 y = 11.527x + 56.412R2 =0.99050.05Panaplate,敵百蟲y=9.760x+37.384R2=0.98010.05Trichlorphon,二嗪磷y=9.4009x+20.107R2=0.99150.05Diazinon,氧樂果y=3.3331x+24.153R2=0.98280.1Omethoate,毒死蜱y=2.5026x+17.196R2=0.98120.1Durshan。

        表2 有機(jī)磷農(nóng)藥酶抑制反應(yīng)方程

        對表2 進(jìn)行分析,能更好地確定大豆酯酶和各農(nóng)藥靈敏度的關(guān)系,具體檢測靈敏度由強(qiáng)到弱順序?yàn)椋壕眯Я祝炯装妨祝緦α蛄祝緮硵澄罚緮嘲傧x>二嗪磷>氧樂果>毒死蜱。

        大豆酯酶對8 種有機(jī)磷類農(nóng)藥的最低檢測限試驗(yàn)結(jié)果見表2,對久效磷甲胺磷、對硫磷、敵敵畏、敵百蟲、二嗪磷的最低檢測限為0.05ppm,而氧樂果和毒死蜱分別為0.1 ppm。可見對此8 種農(nóng)藥的最低檢測限均低于有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測的最低限值要求。因此大豆酯酶可以作為有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測的一種手段。

        三、結(jié)論

        1.通過對26 種大豆種子中的總酯酶含量的比較,篩選出通農(nóng)10、吉林36,長農(nóng)16,吉農(nóng)14,吉農(nóng)6,吉農(nóng)16 等作為有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留檢測的適宜酶源,可以在有機(jī)磷農(nóng)藥檢測方面應(yīng)用。

        2.大豆酯酶對有機(jī)磷類農(nóng)藥有較好的靈敏性,最低檢測線能夠達(dá)到檢測要求,適宜在農(nóng)藥檢測方面應(yīng)用。

        3.本試驗(yàn)研究了有機(jī)磷農(nóng)藥—大豆酯酶的作用關(guān)系,確定了相關(guān)的曲線特征及8 個(gè)酶抑制方程,表明了大豆酯酶對市場上常用的8 種農(nóng)藥有較好的靈敏性,為用酶抑制法進(jìn)行有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留分析提供了參考。

        4.大豆酯酶檢測方法具有操作方便、快速、靈敏、廉價(jià)以及適于非專業(yè)人員現(xiàn)場快速測定的優(yōu)點(diǎn),更適應(yīng)市場的需要。

        [1]周艷麗,李建科,溫艷霞.用于農(nóng)藥檢測的大豆酯酶的純化分離[J].大豆科學(xué),2007,(6).

        [2]韓承輝,谷巍,王乃巖,等.快速測定水中有機(jī)磷農(nóng)藥方法的研究[J].環(huán)境化學(xué),2000,19(2):187.

        [3]張寧.兩種酶快速檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留條件優(yōu)化研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,(1):135-137.

        [4]溫艷霞,李建科.有機(jī)磷農(nóng)殘檢測用植物酯酶的研究[J].食品科學(xué),2006,27(4):123-125.

        [5]Baker J E,F(xiàn)abrick J A,Zhu K Y.Characterization of esterases in malathion—resistant and susceptible strains of the pteromalid parasitoid anisopteromalus calandrae[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,1998,28:l039-l050.

        [6]黃保宏,姚垠.用于檢測農(nóng)藥殘留的植物酯酶的選擇[J].安徽技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào),2004,18(2):15-l7.

        [7]阮長青,楊娟,賈偉.有機(jī)磷農(nóng)藥與小麥酯酶作用關(guān)系研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào),2006,18(1):61-62.

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