方小丹，柯建明，陳振賀，李燁

（北京市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院/國家城市環(huán)境污染控制工程技術(shù)研究中心，北京 100037）

長期以來，抗生素被大量地用于人類和動物細(xì)菌性感染疾病的治療，同時也被作為促生長劑和飼料添加劑以亞治療劑量添加于動物飼料中，在集約化畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用廣泛[1,2]。然而，絕大部分抗生素不能完全被機(jī)體吸收利用，攝入人體和動物體內(nèi)未被代謝的抗生素會經(jīng)不同途徑進(jìn)入環(huán)境，對水體、沉積物和土壤等環(huán)境介質(zhì)造成污染[3~5]。盡管抗生素的半衰期較短，可通過水解、光解與微生物降解等途徑被分解，但由于其使用頻率高、使用量大，導(dǎo)致其在環(huán)境中仍然表現(xiàn)出“假持久性”現(xiàn)象[6]。環(huán)境中殘留的抗生素加速了抗生素抗性菌株的產(chǎn)生與傳播[7]，對人類健康與生態(tài)環(huán)境安全造成了極大威脅。近年來，固相萃取技術(shù)被廣泛用于水體中四環(huán)素類抗生素的預(yù)處理過程中[8]，同時，高效液相色譜技術(shù)的發(fā)展也為四環(huán)素類抗生素的研究提供了更先進(jìn)的檢測方法[9]。目前，環(huán)境水體中四環(huán)素類抗生素的檢測方法主要包括高效液相色譜與紫外聯(lián)用（HPLC-UV）[10]、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）[11]、高效液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）[12]、及超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）[13]等。高效液相色譜法分析時間長，溶劑消耗量大，質(zhì)譜法儀器設(shè)備昂貴。超高效液相與二極管陣列檢測器（UPLC-DAD），能夠克服高效液相色譜法的缺陷，同時儀器成本較低。本研究采用固相萃取-超高效液相色譜法測定水中的四環(huán)素類抗生素，分析時間短，成本低，是環(huán)境水體中四環(huán)素類抗生素測定的通用方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

安捷倫1290 Infinity 超高效液相色譜儀，配有DAD檢測器；安捷倫Elipse Plus C18 RRHD色譜柱（1.8 μm，2.1×50 mm）；十二位固相萃取裝置(美國Supelco公司)；氮吹儀（北京帥恩科技有限責(zé)任公司）。

1.2 試劑

甲醇、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）；超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm)；四環(huán)素、金霉素、土霉素和強(qiáng)力霉素固體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Dr. Ehrenstorfer GmbH）；一水合檸檬酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、乙二胺四乙酸二鈉（分析純，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司）。采用減重法稱量四種四環(huán)素類抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇（含0.1%甲酸）配制成1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于棕色瓶內(nèi)保存于-20℃。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

水樣的富集：使空白水樣通過0.45 μm水系濾膜（上海安譜科學(xué)儀器有限公司），濾去雜質(zhì)，以免阻塞固相萃取小柱。準(zhǔn)確量取過濾后水樣500 mL，加入四環(huán)素類抗生素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時加入0.2 g乙二胺四乙酸二鈉，去除干擾離子。HLB小柱(6 mL/500 mg，Waters公司)預(yù)先用6 mL甲醇活化，6 mL超純水平衡，使水樣以不大于10 mL/min的速率通過HLB小柱。水樣富集完成后，以6mL超純水洗去殘留離子。減壓抽干5分鐘，以6 mL甲醇洗脫目標(biāo)物，氮吹至近干，用初始流動相比例的溶液定容至1mL。

色譜條件：采用梯度洗脫程序（表1），A相為0.01mol/L檸檬酸溶液，B相為乙腈，C相為甲醇。流速為0.4 mL/min，柱溫28℃。DAD檢測器的吸收波長為350 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

表1 UPLC梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of UPLC

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

首先，選用Agilent C18反相色譜柱，選用文獻(xiàn)報(bào)道含0.1%甲酸的水溶液和乙腈作為流動相[14]，對四種四環(huán)素類抗生素進(jìn)行分離，金霉素和強(qiáng)力霉素的色譜峰重疊；改變流動相的梯度，仍不能使二者分離（圖1-a）。然后，改用檸檬酸水溶液（0.01 mol/L）和乙腈作為流動相時，二者的分離度明顯提高。同時，初始流動相比例對于土霉素和四環(huán)素的分離有很大影響：當(dāng)檸檬酸溶液以90%比例起始時，四種抗生素出峰時間在3min之后，土霉素出現(xiàn)肩峰，金霉素和強(qiáng)力霉素的峰有前沿趨勢；當(dāng)檸檬酸溶液以78%比例起始時，土霉素和四環(huán)素之間的分離度下降（圖1-b）；當(dāng)檸檬酸溶液以80%比例起始時，土霉素和四環(huán)素的分離度為3.30，基本達(dá)到基線分離，能夠滿足定性定量分析的要求（圖1-c）。因此，確定以80%檸檬酸溶液、10%乙腈、10%甲醇的作為流動相的起始比例。通常高效液相色譜的分離時間約在20min左右[15]，本方法在4.5分鐘內(nèi)可以完成四種四環(huán)素類抗生素的分離，分析時間大大縮短。

表2 UPLC方法與常見HPLC方法的比較Table 2 Comparison of UPLC method developed with traditional HPLC methods

表2為常用高效液相色譜法與本研究的UPLC方法之間比較。該方法分析時間短、有機(jī)溶劑消耗少，可見該方法具有非常高的分析效率。

2.2 工作曲線、方法檢出限和測定下限

根據(jù)環(huán)境水樣的含量分布選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍，分別設(shè)定50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 μg/L濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，由表1可以看出，四種四環(huán)素類抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程線性關(guān)系良好（r2> 0.999）。測定12份濃度為1.0 μg/L的加標(biāo)水樣，并按照公式1計(jì)算方法檢出限MDL。

k—置信因子為3；s—峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差；c—樣品濃度（μg/L）； —峰面積平均值

表3 四種抗生素的工作曲線、方法檢出限及測定下限Table 3 Calibration curves, method detection and minimum quantitative detection limits

圖1 四種四環(huán)素類抗生素的色譜圖Figure 1 Chromatograms of 4 tetracycline antibiotics

表4 水中四種四環(huán)素類抗生素的回收率（n=3）Table 4 Recoveries of 4 tetracycline antibiotics in water samples (n=3)

從表3可看出四種四環(huán)素類抗生素的方法檢出限在0.36~0.88μg/L之間，與HPLC-MS方法的方法檢出限（0.10 μg/L）相當(dāng)[4]。以公式1中k取10來計(jì)算方法的測定下限[16]，則該方法的測定下限為1.20~2.95μg/L。

2.3 不同加標(biāo)水平下四環(huán)素類抗生素回收情況

于500 mL空白水樣中加入四種四環(huán)素抗生素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加濃度分別為1.0，5.0，9.0 μg/L。加標(biāo)水樣按照1.3的方法進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，低、中、高濃度下四種四環(huán)素抗生素的回收率分別為56.0%~86.3%、68.0%~78.5%、73.8%~80.4%（表4）。

3 結(jié)論

本研究采用固相萃取方法對環(huán)境水樣進(jìn)行富集和凈化，結(jié)合超高效液相方法對水樣中四種四環(huán)素抗生素進(jìn)行分析，建立了固相萃取-超高效液相色譜法測定水中四環(huán)素類抗生素的基本方法。四種抗生素的線性關(guān)系良好（r2> 0.999），能夠滿足水體中抗生素測定的基本要求。低中高三個濃度加標(biāo)回收率分別為56.0%-86.3%，6 8.0%-7 8.5%，7 3.8%-80.4%。土霉素、四環(huán)素、金霉素和強(qiáng)力霉素的檢出限分別為0.71，0.36，0.47，0.88 μg/L，與HPLC-MS方法相當(dāng)。該方法重現(xiàn)性較好，操作簡單，分析時間短，可用于高通量水體樣品中四環(huán)素類抗生素的測定。

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