宓國(guó)強(qiáng)，練青平，汪亞平，胡廷尖，李 倩

(1.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江 湖州 313001;2.淳安千漁網(wǎng)箱養(yǎng)殖專業(yè)合作社，浙江 杭州 311700)

美洲鰣(Alosa sapidissima)屬鯡科(Clupeidae)西鯡屬(Alosa)，棲息于北美洲大西洋東西沿岸的河流和海洋中，為溯河產(chǎn)卵洄游性魚類［1］。因美洲鰣與中國(guó)鰣(Macrura reevesii)的外形相似，味道可與我國(guó)鰣魚媲美，深受市場(chǎng)歡迎，市場(chǎng)價(jià)格在400 元/kg 左右。近幾年來(lái)，我國(guó)從美國(guó)引進(jìn)美洲鰣的受精卵進(jìn)行孵化和種苗培育，并逐步開展成魚的池塘和網(wǎng)箱養(yǎng)殖［2-8］。但一是由于美洲鰣的受精卵是由在美國(guó)當(dāng)?shù)氐囊吧后w人工受精獲得，數(shù)量有限。二是受精卵從美國(guó)運(yùn)到中國(guó)需20 h 以上，加上兩地水溫差異，造成魚苗的孵化率不高，也影響苗種的質(zhì)量。因此，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的逐步擴(kuò)大，美洲鰣受精卵供不應(yīng)求。為了滿足日益增大的養(yǎng)殖美洲鰣所需要的苗種，擺脫完全依靠進(jìn)口的被動(dòng)局面，國(guó)內(nèi)許多學(xué)者進(jìn)行了美洲鰣的人工繁殖技術(shù)的研究探索，取得了一定成功，但尚難形成規(guī)模［9-15］。所以，有必要進(jìn)行對(duì)淡水養(yǎng)殖下的美洲鰣進(jìn)行全人工繁殖技術(shù)的研究。

2013 年5 月9 日，我們對(duì)2011 年6 月引進(jìn)、在淳安千漁網(wǎng)箱養(yǎng)殖專業(yè)合作社的水庫(kù)網(wǎng)箱養(yǎng)殖基地養(yǎng)殖3 年、性腺成熟的親魚進(jìn)行了人工繁殖試驗(yàn)。本研究在美洲鰣人工催產(chǎn)、授精成功的基礎(chǔ)上，對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程的時(shí)序和形態(tài)特征進(jìn)行詳細(xì)的觀察，旨在為美洲鰣的人工繁殖和苗種生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。同時(shí)，也可豐富魚類早期發(fā)育的內(nèi)容。

1 材料和方法

1.1 親魚培育

試驗(yàn)用美洲鰣親本來(lái)源于淳安千漁網(wǎng)箱養(yǎng)殖專業(yè)合作社的網(wǎng)箱養(yǎng)殖基地。該親本是淳安千漁網(wǎng)箱養(yǎng)殖專業(yè)合作社于2011 年6 月從美國(guó)引入受精卵孵化后在網(wǎng)箱養(yǎng)殖而成，親魚體質(zhì)量為1 000～1 300 g，魚齡為3 齡。在養(yǎng)殖過(guò)程中，以投喂鱘魚配合飼料為主。

1.2 人工授精與孵化條件

選取性腺成熟度好，體表無(wú)擦傷的美洲鰣作為試驗(yàn)親魚。親魚經(jīng)注射催產(chǎn)激素后放回網(wǎng)箱中，用微流水進(jìn)行刺激。催產(chǎn)激素為馬來(lái)酸地歐酮(DOM)、促黃體素釋放激素2 號(hào)(LHRH-A2)和絨毛膜促性腺激素(HCG)的混合激素。采用1 次注射，注射部位為背鰭基部，待效應(yīng)時(shí)間到達(dá)后，采用半干法授精獲得美洲鰣的受精卵，并將受精卵放入孵化缸中進(jìn)行孵化。孵化用水為水庫(kù)天然水，其水溫為(21.5±0.5)℃，pH 為8.5，溶解氧為7.5～8 mg/L。

1.3 胚胎發(fā)育觀察及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

胚胎發(fā)育觀察時(shí)，每次隨機(jī)取30 枚受精卵，在ZOOM645S 連續(xù)變倍體視顯微鏡下進(jìn)行觀察，每次以50%以上的受精卵進(jìn)入下一發(fā)育時(shí)期為準(zhǔn)，并記錄下胚胎發(fā)育各階段的時(shí)序和形態(tài)特征。同時(shí)用CanonA700 型相機(jī)拍照。圖片后期用Adobe Photoshop CS6 軟件進(jìn)行處理。胚胎發(fā)育的有效積溫計(jì)算參照徐革鋒等計(jì)算方法［16］。其胚胎發(fā)育積溫計(jì)算公式如下:

K=T·N

式中:T 表示發(fā)育期間的平均水溫(℃);N 表示完成某一發(fā)育時(shí)期所需要的時(shí)間(h);K 表示完成某一發(fā)育時(shí)期的發(fā)育所需要的有效積溫(℃·h)。

2 結(jié)果分析

2.1 胚胎發(fā)育

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在孵化水溫在(21.5±0.5)℃條件下，美洲鰣受精卵經(jīng)過(guò)66 h 30 min 孵化出膜，鰣魚受精卵完成胚胎發(fā)育所需的積溫為1 463(℃·h)，胚胎發(fā)育進(jìn)程見表1。按照胚胎發(fā)育的形態(tài)特征，可將美洲鰣的胚胎發(fā)育過(guò)程劃分為7 個(gè)階段:卵裂前期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成期、孵化出膜期。從受精至出膜共計(jì)29 個(gè)胚胎發(fā)育特征和發(fā)育時(shí)序見圖1 和圖2。

2.1.1 卵裂前期 發(fā)育至成熟的卵呈卵圓形，為金黃色或者淺黃色的沉性卵，卵黃均勻分布。美洲鰣的受精卵遇水開始吸水膨脹，卵膜透明，無(wú)粘性，無(wú)油球(圖1-1)。受精卵卵裂方式為盤狀卵裂，屬端黃卵，約15～20 min 后吸水膨脹完成，最終卵徑為(3.15±0.15)mm，卵周隙為0.8 mm。受精后30 min，積溫達(dá)到11(℃·h)時(shí)，原生質(zhì)由植物極向動(dòng)物極遷移，此時(shí)，胚胎呈梨形，在動(dòng)物極逐漸聚集隆起形成胚盤，胚盤形成(圖1-2)。

表1 美洲鰣的胚胎發(fā)育Tab.1 Embryonic development ofAlosa sapidissima

2.1.2 卵裂期 受精后50 min，積溫達(dá)到18.26(℃·h)時(shí)，在胚盤中央出現(xiàn)分裂溝，胚盤分裂成2 個(gè)大小相等的分裂球，進(jìn)入2 細(xì)胞期(圖1-3)，隨著細(xì)胞的繼續(xù)發(fā)育，受精后1 h 15 min，細(xì)胞再次分裂，分裂溝與第一次垂直，形成4 個(gè)大小相等的分裂球(圖1-4)，受精后1 h 30 min，分裂球繼續(xù)分裂，與第一次分裂面平行，形成8 個(gè)分裂球排成2 排，進(jìn)入8 細(xì)胞期(圖1-5)，此后，分裂球數(shù)目呈幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)，分別繼續(xù)發(fā)育至16 細(xì)胞、32 細(xì)胞、64 細(xì)胞期等(圖1-6-7)。受精后4 h，積溫達(dá)到88(℃·h)時(shí)，分裂球越分裂越小，越分裂越多，形成多細(xì)胞胚體(圖1-8)，其大小猶如桑椹，此時(shí)進(jìn)入桑椹期(圖1-9)。

2.1.3 囊胚期 受精后5 h 10 min，積溫達(dá)到113.74(℃·h)時(shí)，細(xì)胞分裂球越來(lái)越小，細(xì)胞界線不清楚，胚盤高度達(dá)發(fā)育期的最高，在動(dòng)物極形成的囊胚層被卵黃高高舉起，似帽狀，進(jìn)入囊胚早期(圖1-10)。受精后6 h 35 min，囊胚層高度較囊胚早期變低，胚層逐漸趨向扁平，細(xì)胞已經(jīng)向下擴(kuò)散，囊胚層的面積正不斷擴(kuò)大，進(jìn)入囊胚中期(圖1-11)。受精后8 h 30 min，囊胚層細(xì)胞下包已經(jīng)明顯，約占整個(gè)胚胎的1/3，囊胚層變扁平，緊貼卵黃，進(jìn)入囊胚晚期(圖1-12)。

圖1 美洲鰣的胚胎發(fā)育Fig.1 Embryonic development of Alosa sapidissima

2.1.4 原腸胚期 受精后12 h，積溫達(dá)到264(℃·h)時(shí)，囊胚層邊緣細(xì)胞向下包，內(nèi)卷逐漸明顯，約占整個(gè)胚胎的1/2，胚環(huán)出現(xiàn)，進(jìn)入原腸早期(圖1-13)。受精后14 h 30 min，胚層繼續(xù)下包至2/3 處，胚盾出現(xiàn)，進(jìn)入原腸中期(圖1-14)。受精后15 h 25 min，胚層下包至3/4～4/5 處，胚盾逐漸伸長(zhǎng)，較明顯，進(jìn)入原腸晚期(圖1-15)。

2.1.5 神經(jīng)胚期 受精后16 h，積溫達(dá)到344(℃·h)時(shí)，胚層下包至4/5 處，卵黃栓和神經(jīng)板形成，胚體轉(zhuǎn)為側(cè)臥，可見部分胚體，胚體未完全形成，胚胎進(jìn)入神經(jīng)胚期(圖1-16)。受精后17 h，胚孔封閉，卵黃囊被全部包入，脊索形成柱狀，胚體前部稍隆起，頭部雛形形成，進(jìn)入胚孔封閉期(圖2-1)。

2.1.6 器官形成期 受精后24 h 10 min，積溫達(dá)到519.65(℃·h)時(shí)，胚體前部隆起，胚體中部出現(xiàn)3～4 對(duì)肌節(jié)，整個(gè)胚體長(zhǎng)度約為卵黃囊周長(zhǎng)的1/3，進(jìn)入肌節(jié)出現(xiàn)期(圖2-2);受精后25 h 30 min，在胚體頭部出現(xiàn)1 對(duì)長(zhǎng)橢圓形眼囊，脊索更加明顯，進(jìn)入眼囊期(圖2-3);受精后32 h 10 min，胚體伸長(zhǎng)，在胚體后端出現(xiàn)圓錐形突起尾芽，胚體尾部和卵黃囊被分割，進(jìn)入尾芽期(圖2-4);受精后33 h 40 min，尾芽逐漸伸長(zhǎng)，在眼杯中出現(xiàn)圓形的晶體，進(jìn)入晶體出現(xiàn)期(圖2-5);受精后37 h，在胚體尾部出現(xiàn)鰭?cǎi)?，原先的尾芽變得扁平，在卵黃囊上出現(xiàn)許多星狀的黑色素，此時(shí)進(jìn)入尾鰭出現(xiàn)期(圖2-6);受精后38 h 20 min，在脊索前方出現(xiàn)泡狀耳囊(圖2-7)。受精后40 h，在卵黃囊前上方，頭部下方，管狀心臟出現(xiàn)，開始微弱的心跳，心跳可達(dá)100～120 次/min，進(jìn)入心跳期(圖2-8);受精后42 h 55 min，胚體繼續(xù)伸長(zhǎng)，尾已基本形成，在胚體后部約占胚體的1/2 已經(jīng)游離于卵黃，胚體開始表現(xiàn)出微弱的顫動(dòng)，無(wú)規(guī)律性，扭動(dòng)可達(dá)4 次/min，進(jìn)入肌肉效應(yīng)期(圖2-9);受精后47 h 50 min，在眼囊后方的耳囊中出現(xiàn)1 對(duì)發(fā)亮的鈣質(zhì)耳石，進(jìn)入耳石出現(xiàn)期(圖2-10);受精后55 h 50 min，整個(gè)胚體包繞卵黃囊約3/4，眼球內(nèi)部開始出現(xiàn)少量黑色素，而在卵黃囊上黑色素逐漸明顯，進(jìn)入眼色素形成期(圖2-11)。

圖2 美洲鰣的胚胎發(fā)育Fig.2 Embryonic development of Alosa sapidissima

2.1.7 孵化出膜期 受精后59 h 50 min，積溫達(dá)到1 309(℃·h)時(shí)，眼色素繼續(xù)加深，胚體在膜內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)加快20～25 次/分，進(jìn)入出膜前期(圖2-12);受精后66 h 30 min，眼色素繼續(xù)加深，卵膜開始變薄，胚體體表無(wú)黑色素，胚體扭動(dòng)次數(shù)增加且扭動(dòng)幅度轉(zhuǎn)為劇烈的顫動(dòng)，為48～60 次/min，仔魚出膜方式大多數(shù)以尾部先出膜，也有頭部先出膜的，進(jìn)入出膜期(圖2-13)。

2.2 初孵仔魚形態(tài)特征及活動(dòng)情況

初孵仔魚全長(zhǎng)6.9～7.1 mm，體透明，卵黃囊上有分散的星狀黑色素，眼晶體內(nèi)黑色素明顯，仔魚卵黃囊較大，呈橢圓形，長(zhǎng)徑為(2.15±0.10)mm，短徑為(1.9±0.15)mm，圍心腔在卵黃囊前上方和頭部下方，可見心跳，頻率約140 次/min。在胚體的左右耳囊內(nèi)可見2 顆耳石。初孵仔魚口未開，消化道和肛門尚未發(fā)育貫通，初孵仔魚無(wú)平游能力，只能靜臥在水底或貼在孵化缸壁上，偶爾做直線竄動(dòng)，具有顯著的趨光性(圖2-14)。

3 討論

3.1 美洲鰣受精卵的特點(diǎn)

硬骨魚類魚卵分為浮性卵和沉性卵，而沉性卵又分為粘性卵、沉性卵，此類沉性卵密度稍大于水，在靜水中沉入水底，在水流中能隨流漂浮發(fā)育，亦稱半浮性卵［17］。本研究發(fā)現(xiàn)美洲鰣受精卵屬于沉性卵中的半浮性卵類型。與洪孝友等［10］和徐鋼春等［15］等研究認(rèn)為美洲鰣受精卵屬沉性卵一致。中國(guó)鰣魚報(bào)道為半漂浮性卵，其實(shí)也屬沉性卵，與美洲鰣的受精卵類型應(yīng)該一樣。洪孝友等［10］研究報(bào)道美洲鰣受精卵徑為2.85～3.28 mm，沒(méi)有油球，與本研究中發(fā)現(xiàn)美洲鰣受精卵卵徑(3.15±0.15)mm，無(wú)油球等結(jié)果一致，而與徐鋼春等［15］研究報(bào)道美洲鰣受精卵徑為(4.03±0.25)mm，不具油球結(jié)果不一致。原因可能是繁殖親本的種群不同，也可能是親本培育的環(huán)境、投喂的飼料不同所致。魚類卵的大小對(duì)種的早期發(fā)育和存活具有重要的生態(tài)學(xué)意義，大卵在種內(nèi)被認(rèn)為有利于仔魚建立初次攝食、生長(zhǎng)、避敵和提高存活率［17］。美洲鰣的受精卵卵徑要大于中國(guó)鰣魚的卵徑(1.37～2.20)mm［18］，這有助于美洲鰣?jiān)谧匀画h(huán)境中提高存活率。

油球，又稱油滴，是許多海產(chǎn)硬骨魚卵的特殊組成部分，為內(nèi)含中性脂肪，對(duì)浮性卵不僅是養(yǎng)料的儲(chǔ)藏，也起浮子的作用。香魚(Plecoglossus altivelis)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)等魚卵都具有油球［19-20］，中國(guó)鰣魚也具有油球，而美洲鰣不具有油球，這說(shuō)明美洲鰣雖然屬溯河產(chǎn)卵洄游性魚類，與其自身的所適應(yīng)的生態(tài)環(huán)境有關(guān)。

3.2 美洲鰣胚胎發(fā)育的特征

徐鋼春等［15］研究認(rèn)為美洲鰣受精卵在水溫(20±1)℃條件下，歷時(shí)約71 h 40 min 完成整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程。洪孝友等［10］研究認(rèn)為美洲鰣受精卵在水溫(20.3～21.9)℃條件下，經(jīng)過(guò)82 h 孵化出膜。本研究認(rèn)為孵化水溫在(21.5±0.5)℃條件下，美洲鰣受精卵經(jīng)過(guò)66 h 30 min 孵化出膜，積溫為1 463(℃·h)，其胚胎發(fā)育時(shí)間相差不大，基本相似。而中國(guó)鰣魚在水溫26.5～27.5 ℃條件下，鰣魚受精卵經(jīng)過(guò)17 h～18 h 30 min可孵化出膜，胚胎發(fā)育總積溫需要438～481(℃·h)［17］，這可能是不同魚類的種間差異所造成的。

美洲鰣的胚胎發(fā)育過(guò)程劃分為7 個(gè)階段，共計(jì)29 個(gè)發(fā)育時(shí)期，歷時(shí)66 h 30 min，而中國(guó)鰣魚胚胎發(fā)育分為22 個(gè)發(fā)育分期，歷時(shí)17 h 發(fā)育出膜，其發(fā)育分期都基本相同，只是各分期發(fā)育時(shí)間間隔和發(fā)育速度不同。中國(guó)鰣魚初孵仔魚體長(zhǎng)為2.71～2.87 mm，而美洲鰣出膜時(shí)候初孵仔魚全長(zhǎng)為6.9～7.1 mm，是中國(guó)鰣魚初孵仔魚體長(zhǎng)的2 倍多，這對(duì)于物種的延續(xù)意義重大，在自然水域環(huán)境中可以很大程度上提高其幼魚的成活率。

美洲鰣受精卵在孵化過(guò)程中，在胚胎發(fā)育到達(dá)原腸期時(shí)，其未受精的魚卵就會(huì)變白停止發(fā)育，如把死卵繼續(xù)留在孵化器具中，死卵很容易滋生水霉，這樣會(huì)粘上正常發(fā)育的受精卵，造成美洲鰣受精卵孵化率降低，所以在受精卵孵化過(guò)程中，為了提高美洲鰣的出苗率，要及時(shí)人工剔除死卵，以保證正常發(fā)育的受精卵不被粘住。

研究認(rèn)為硬骨魚類受精卵胚胎發(fā)育進(jìn)程隨著孵化水溫的升高而加快，其胚胎發(fā)育時(shí)間與孵化水溫呈負(fù)相關(guān)。美洲鰣孵化溫度為15.5～20.6 ℃時(shí)孵化幼苗成活率最大，溫度低于7～9 ℃會(huì)很快導(dǎo)致卵和幼苗的死亡，溫度超過(guò)23.4 ℃時(shí)會(huì)導(dǎo)致幼苗大部分出現(xiàn)畸形［6］。這與本實(shí)驗(yàn)中觀察到的現(xiàn)象完全一致，在孵化水溫超過(guò)23 ℃時(shí)，美洲鰣的出苗時(shí)候出現(xiàn)了大量的畸形苗，這就要求生產(chǎn)苗種單位要把美洲鰣受精卵孵化水溫一直控制在23 ℃以下。

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