杜振元

遼寧省朝陽市第二醫(yī)院檢驗科，遼寧朝陽 122000

診斷原料用酶的性質(zhì)是決定酶法試劑質(zhì)量的關(guān)鍵，因此對臨床診斷用酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究具有重要意義[1]。谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase,GLDH)是生物體代謝途徑中一種重要的酶類，谷氨酸脫氫酶可分為NAD 依賴型（EC1.4.1.2）、NAD（P）依賴型（EC1.4.1.3）及NADP 依賴型（EC 1.4.1.4）。酶法尿素氮試劑用到的谷氨酸脫氫酶是NAD 依賴型（EC1.4.1.2），該種谷氨酸脫氫酶一般不太穩(wěn)定，只有在硫酸銨溶液中才不容易失活[2-3]。谷氨酸脫氫酶可以用于多種生化診斷試劑的配制，谷氨酸脫氫酶是配制尿素氮試劑盒(速率法)所需兩種酶之一，尿素氮的含量反應(yīng)蛋白的分解代謝和腎臟功能[4]。此外，谷氨酸脫氫酶還可用于血氨試劑盒和K 離子試劑盒測定等[5-6]。國內(nèi)有文獻(xiàn)對谷氨酸脫氫酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行過報道[7]，但是沒有說明酶的出處。該文對一種國產(chǎn)谷氨酸脫氫酶的酶學(xué)進(jìn)行研究，證明該種谷氨酸脫氫酶酶學(xué)性質(zhì)符合酶法尿素氮試劑盒的原料用酶要求。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

谷氨酸脫氫酶由北京邁迪卡科技有限公司生產(chǎn)；NADH 和α-酮戊二酸購于Sigma 公司，Tris 和NH4Cl 是國產(chǎn)生化分析純試劑；檢測儀器是Olympus AU400 全自動生化分析儀器和島津2450 紫外可見分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 谷氨酸脫氫酶活力的測定 該法以α-酮戊二酸、銨離子及還原型輔酶I（NADH）為底物，在谷氨酸脫氫酶催化作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼岷脱趸洼o酶I（NAD），利用NADH 在340 nm 處有吸收峰，監(jiān)測其反應(yīng)速率（-△A/min），計算谷氨酸脫氫酶的活力單位。反應(yīng)混合液的pH 為8.3，含有0.1 mol/L 的Tris-Cl、0.2 mol/L的氯化銨、0.01 mol/L 的α-酮戊二酸和一定量的酶液。所有酶活測定，如果未作特殊說明，反應(yīng)體系溫度均為37 ℃。

1.2.2 谷氨酸脫氫酶米氏常數(shù)的測定 采用Linewaeaver―Burk作圖法（雙倒數(shù)作圖法）對谷氨酸脫氫酶的米氏常數(shù)進(jìn)行測定。所有酶活測定，如果未作特殊說明，反應(yīng)體系溫度均為37℃。

2 結(jié)果

2.1 谷氨酸脫氫酶pH 穩(wěn)定性的測定

將一定量的谷氨酸脫氫酶稀釋至pH 為4～12 的緩沖液中，25 ℃條件下放置20 h。其中，pH 4～6 為醋酸緩沖液，pH 6～8 范圍為磷酸鹽緩沖體系；pH 8～10 為Tris-Cl 緩沖體系，pH10～12 為甘氨酸緩沖體系。然后37 ℃條件下測定殘存谷氨酸脫氫酶的活力。實驗表明該種谷氨酸脫氫酶具有pH 作用范圍廣的優(yōu)點，在pH 為5～10 范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，酶殘存活力在90%以上。見圖1。

圖1 谷氨酸脫氫酶pH 穩(wěn)定性

2.2 谷氨酸脫氫酶最適反應(yīng)溫度的測定

溫度是影響酶作用的重要因素。酶反應(yīng)的速度隨溫度的變化而變化。通常溫度每增加10 ℃，酶反應(yīng)速度增加1～2倍。在一定條件下，每種酶都有一個最適宜的作用溫度，在最適溫度下酶的活力最高，作用效果最好。為了測定谷氨酸脫氫酶的活力，取一定量的谷氨酸脫氫酶稀釋至pH 為8.3 的0.1mol/L 的Tris-Cl緩沖液中，然后在島津2450 紫外分光光度計上將反應(yīng)溫度分別調(diào)整至30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃條件，試劑保溫1 min，然后加入稀釋好的谷氨酸脫氫酶測定活力。實驗表明該種谷氨酸脫氫酶的最適反應(yīng)溫度是45 ℃。見圖2。

圖2 谷氨酸脫氫酶最適反應(yīng)溫度的測定

2.3 谷氨酸脫氫酶最適pH 的測定

酶在一定的較狹的pH值范圍內(nèi)表現(xiàn)出最高活力，這個pH值就是酶作用的最適pH值。高于或低于這一pH值，酶的穩(wěn)定性下降，活性受到影響。為了測定谷氨酸脫氫酶的最適pH，配制如下種類緩沖液：pH 范圍為6～7.5 的0.1 M 磷酸鉀緩沖液；pH范圍為6～7.5 的0.1 M Tris-HCL 緩沖液；pH 范圍為8.5～10.5 的0.1 M 甘氨酸緩沖液。以上3種緩沖液中含有0.1 mol/L 的氯化銨、0.01 mol/L 的α-酮戊二酸和7.5 mmol/L 的NADH。取一定量的谷氨酸脫氫酶稀釋至pH 為8.3 的0.1 mol/L 的Tris-Cl 緩沖液中。然后37 ℃條件下測定谷氨酸脫氫酶在不同pH條件下的活力。實驗結(jié)果表明谷氨酸脫氫酶最適pH值是7.5，實驗結(jié)果見圖3。

圖3 谷氨酸脫氫酶最適pH 的測定

2.4 谷氨酸脫氫酶Km值的測定

米氏常數(shù)（Km）是酶的特征性常數(shù)，Km 只與酶的種類、反應(yīng)體系的pH 和反應(yīng)溫度有關(guān)系，而與酶的濃度和底物的濃度無關(guān)。酶的米氏常數(shù)越大，說明需要的底物濃度越高，所以酶的Km數(shù)值是反應(yīng)酶性質(zhì)優(yōu)略的重要指標(biāo)。筆者利用Lineweaver－Burk作圖法對谷氨酸脫氫酶催化正反應(yīng)的3個底物（NN4、α-酮戊二酸、NADH）的米氏常數(shù)（3），根據(jù)直線在橫軸上的截距（1/Km），求得米氏常數(shù)Km。實驗表明，麥迪卡公司產(chǎn)谷氨酸脫氫酶的米氏常數(shù)與進(jìn)口知名品牌相比相差不大，見表1。

表1 谷氨酸脫氫酶各種底物的米氏常數(shù)（mol/L）

3 討論

診斷試劑原料用酶屬于酶制劑行業(yè)的一個小分支，與工業(yè)用酶不同，生化診斷試劑用原料酶理化性質(zhì)要求較高。一種好的診斷試劑原料酶應(yīng)當(dāng)具有條件是熱穩(wěn)定性好、pH 穩(wěn)定范圍寬，Km 數(shù)值較低。目前，國內(nèi)對診斷原料用酶研究較少，對新的診斷用原料用酶的酶學(xué)性質(zhì)研究更是相對滯后。所以對國產(chǎn)診斷用原料酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究對正確使用酶法診斷試劑有指導(dǎo)意義。

該研究對麥迪卡公司生產(chǎn)的谷氨酸脫氫酶的酸堿耐受范圍、熱穩(wěn)定性、最適溫度、最適pH 和Km 進(jìn)行了測定。該種谷氨酸pH 耐受范圍較寬，在pH 為5～10 范圍內(nèi)保持較好的穩(wěn)定性；熱穩(wěn)定性較好，50 ℃加熱20 min，酶活保留87.5%；酶動力學(xué)研究表明該種谷氨酸脫氫酶3個底物的米氏常數(shù)分別為：NN4＋是10.4×10-3mol/L；α-酮戊二酸是7.42×10-3mol/L；輔酶I（NADH）是6.65×10-4mol/L。實驗結(jié)果表明，麥迪卡公司生產(chǎn)的谷氨酸脫氫酶酶學(xué)性質(zhì)較好，適合臨床診斷試劑盒使用。

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