劉 永，王 平，吳 越，彭常安，姜雯翔，袁 曄，韓永斌＊

（1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程系，安徽 蕪湖 241006；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095）

藍(lán)莓（Blueberry）果實(shí)營養(yǎng)豐富，尤其是藍(lán)莓果皮中含有的大量的花色苷（Anthocyanin）類物質(zhì).花色苷主要存在于細(xì)胞的液胞中，屬水溶性黃酮多酚類化合物，是一種優(yōu)良的氧自由基清除劑和脂質(zhì)過氧化抑制劑[1]，并且對癌癥、過敏、炎癥、視疲勞、心腦血管疾病等近100多種疾病具有直接或間接的預(yù)防和治療作用.因此，藍(lán)莓被聯(lián)合國糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一.

花色苷的提取方法主要有溶劑法、酶法、發(fā)酵法以及超臨界CO2提取[2]，為提高色素得率，還可采用超聲波、微波、脈沖電場及高壓水法等技術(shù)破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，從而縮短提取時間.花色苷在中性和弱堿性溶液中不穩(wěn)定，通常采用酸性溶劑進(jìn)行提取，設(shè)備簡單，但效率較低[3].超聲輔助提取是利用超聲波強(qiáng)烈的空化效應(yīng)促進(jìn)植物細(xì)胞壁的裂解和細(xì)胞內(nèi)含物的溶出，可顯著縮短提取時間，提高提取率，同時避免了高溫對提取物質(zhì)的影響，已大量應(yīng)用于天然植物有效成份的提取[4].因此，本文采用超聲輔助熱水提取藍(lán)莓果漿中的花色苷，并與酶提取工藝獲得的花色苷進(jìn)行提取率和組分比較，以獲得最佳提取工藝參數(shù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

藍(lán)莓（品種Garden blue），南京新得利食品有限公司提供，2012年7月10日采收后，裝入泡沫箱中用冰塊冷卻，2 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，5℃冰柜保存3 h后進(jìn)行試驗(yàn)；安琪果酒酵母，武漢安琪釀造有限公司；纖維素酶1 200 U／g，愛頓生物工程有限公司；乙腈 色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇、鹽酸和甲醇等均為分析純，南京化學(xué)試劑有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-250B型超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；Agilent 1200液相色譜儀，配有可變波長紫外檢測器和安捷倫色譜工作站，美國安捷倫公司；UV-2802紫外可見分光光度計(jì)，美國尤尼克公司.

1.3 試驗(yàn)方法

（1）花色苷含量測定及提取率計(jì)算.準(zhǔn)確稱取3 g藍(lán)莓果漿，加入1%HCl-甲醇溶液30 m L，35℃水浴1 h，每隔10 min攪拌1次，重復(fù)提取4次.提取液經(jīng)減壓蒸餾（40℃）除去甲醇后加1%HCl-H2O溶液定容至50 m L.取1 m L該提取液，加4 m L酸化乙醇（V1.5mol／LHCl∶V95%乙醇＝15∶85），避光靜置30 min，測定520 nm下花色苷吸光度值A(chǔ).花色苷含量以矢車菊-3-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)物按下式計(jì)算：

式中：A為吸光度值；Mw為矢車菊-3-葡萄糖苷的分子量（449.2）；ε為摩爾消光系數(shù)（26 900）；DF為稀釋倍數(shù).經(jīng)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)物中花色苷含量為2 800 mg／L，花色苷提取率計(jì)算公式為：

（2）超聲輔助提取單因素試驗(yàn).將超聲功率調(diào)至200 W，選擇提取時間、提取溫度、超聲時間和稀釋倍數(shù)4因素進(jìn)行單因素分析，處理如下：①提取溫度70℃、超聲時間40 min和稀釋倍數(shù)6倍時，考察提取時間為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210和240 min時花色苷提取率的變化；②提取時間150 min，超聲時間40 min和稀釋倍數(shù)6倍時，考察溫度為30℃、50℃、70℃和90℃時花色苷提取率的變化；③提取時間150 min、提取溫度70℃和稀釋倍數(shù)6倍時，考察超聲時間為20 min、30 min、40 min、50 min和60 min時花色苷提取率的變化；④提取時間150 min、提取溫度70℃和超聲時間40 min時，考察稀釋倍數(shù)為2、3、4、5、6和7時花色苷提取率的變化.

（3）Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化花色苷提取工藝原料品質(zhì)分析.在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，采用SAS軟件分析得到花色苷最佳提取工藝參數(shù)，并進(jìn)行驗(yàn)證.

（4）傳統(tǒng)酶法提取工藝.按5 mg／L纖維素酶加入到去離子水稀釋倍數(shù)為7.8的藍(lán)莓果漿中，50℃水浴180 min提取花色苷.以未加酶處理為對照1（CK1）和藍(lán)莓果加同樣稀釋倍數(shù)的去離子水打漿，加熱至90℃滅酶3 min過濾、靜置180 min的藍(lán)莓汁為對照2（CK2），上述樣品冷卻4℃下12 000 r／min離心10 min，取上清液，進(jìn)行紫外-可見分光光度計(jì)在波長280～600 nm范圍下掃描圖譜和HPLC分析.

（5）花色苷組分分析.HPLC條件：Agilent TC-C18柱（4.6×250 mm，5μm）；柱溫30℃；流動相為甲酸、乙腈，流速0.5 m L／min；檢測波長520 nm；進(jìn)樣量20μL；檢測時間40 min.其中流動相采用梯度洗脫方法，甲酸濃度變化梯度為：0～5 min時，甲酸濃度10%～12%；5%～14 min，12%～13%；14%～16 min，13%～14%；16～18 min，14%～16%；18～19 min，16%～18%；19～22 min，18%～22%；22～35 min，22%～30%[5].

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果以ˉX±S形式表示，采用Excel和SAS軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓果漿花色苷超聲輔助提取單因素試驗(yàn)

（1）提取時間對藍(lán)莓花色苷提取率的影響如圖1所示.由圖1可見，花色苷提取率隨提取時間的延長而升高，在120 min時達(dá)到最大值38.52%；進(jìn)一步延長提取時間，花色甘提取率下降.原因可能是隨著提取時間的繼續(xù)延長，影響花色苷的穩(wěn)定性，使其部分降解，提取量下降[2].藍(lán)莓花色苷穩(wěn)定性差，較易氧化，長時間提取會大大增加其損失[3].

“星星急救”教學(xué)方式多樣化，采用情景再現(xiàn)、模擬演示、應(yīng)急演練、健康講座等多種方式相結(jié)合的形式，為社會公眾提供培訓(xùn)服務(wù)。太和醫(yī)院提供的資料顯示，小分隊(duì)以情景劇開展急救知識的科普宣傳活動，獲得了國家知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)。

（2）提取溫度對藍(lán)莓花色苷提取率的影響如圖2所示.提取一方面可以促進(jìn)藍(lán)莓果實(shí)細(xì)胞壁的降解，提高出汁率，因此溫度的升高有助于花色苷提取率的增加；另一方面，當(dāng)溫度高于60℃時，花色苷穩(wěn)定性較差，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，甚至降解，使其提取量或者檢測值降低[3].由圖2可見，當(dāng)提取溫度為70℃時，花色苷提取率達(dá)最大值37.75%，但進(jìn)一步升高溫度導(dǎo)致花色苷的降解，花色苷提取率下降.

（3）超聲時間對藍(lán)莓花色苷提取率的影響如圖3所示.超聲提取主要是利用超聲振動能量使細(xì)胞周圍及胞內(nèi)產(chǎn)生環(huán)流，提高細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，有利于提高果漿中花色苷的提取率.由圖3可見，隨著超聲時間的延長，游離態(tài)花色苷逐漸溶出，當(dāng)超聲處理40 min時，果汁中花色苷的提取率達(dá)最大值38.02%；但隨著超聲時間的進(jìn)一步延長，其產(chǎn)生的熱效應(yīng)會導(dǎo)致部分花色苷發(fā)生氧化降解，花色苷提取率下降.

（4）稀釋倍數(shù)對藍(lán)莓花色苷提取率的影響如圖4所示.由圖4可見，隨著稀釋倍數(shù)的增大，提高了分子擴(kuò)散速率，縮短了平衡時間，溶液傳質(zhì)作用的加強(qiáng)促進(jìn)了.果漿中花色苷的溶出[6]，導(dǎo)致其提取率升高.當(dāng)稀釋倍數(shù)為6時，達(dá)到最大值40.61%.隨著稀釋倍數(shù)進(jìn)一步增大，花色苷提取率趨于穩(wěn)定.

圖1 提取時間對藍(lán)莓花色苷提取率的影響

圖2 提取溫度對藍(lán)莓花色苷提取率的影響

圖3 超聲時間對藍(lán)莓花色苷提取率的影響

圖4 稀釋倍數(shù)對藍(lán)莓花色苷提取率的影響

2.2 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及響應(yīng)面優(yōu)化花色苷提取工藝

Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，SAS軟件分析結(jié)果如表2所示.花色苷提取率理論模型的檢驗(yàn)P值為0.000 1，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；決定系數(shù)為0.959 5，說明此模型擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間的線性關(guān)系顯著，可用于花色苷提取率的理論預(yù)測.此外對方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，方程中X1、X2以及交互項(xiàng)均表現(xiàn)不顯著，但平方項(xiàng)表現(xiàn)顯著（見表2）.因此得到簡化后的數(shù)學(xué)模型：Y式中，Y代表花色苷提取率，X1為提取時間，X2為提取溫度，X3為超聲時間，X4為稀釋倍數(shù).

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 回歸方程方差分析表

為更好地反映稀釋倍數(shù)、提取溫度、提取時間和超聲時間4因素對花色苷提取率的影響，運(yùn)用SAS軟件分析得到響應(yīng)曲面圖如圖5所示.由圖5可見，當(dāng)固定任意3個因素時，花色苷提取率都隨第4個因素水平的升高而升高；當(dāng)達(dá)到一定值后，提取率又隨之下降或者上升趨勢變緩.4因素對花色苷提取率的影響大小順序?yàn)橄♂尡稊?shù)＞超聲時間＞提取時間＞提取溫度，這與方差分析的結(jié)果一致.

圖5 花色苷提取響應(yīng)曲面圖

2.3 藍(lán)莓花色苷不同提取方法比較

（1）不同提取方法對花色苷提取率的影響如圖6所示.由圖6可見，傳統(tǒng)酶法提?。‥）的花色苷提取率比未經(jīng)酶處理樣（CK1）高4.48%，比靜置相同時間的藍(lán)莓汁不同提取方法對藍(lán)莓花色苷提取率的影響（CK2）高21.02%，這表明酶處理對花色苷溶出有一定促進(jìn)作用，可能是纖維素酶破壞了細(xì)胞壁，釋放出胞內(nèi)物質(zhì)，花色苷提取率升高.但與最優(yōu)超聲輔助提取工藝（S）相比，花色苷提取率低12.96%.原因可能是超聲不僅導(dǎo)致游離花色苷的溶出，同時也導(dǎo)致部分與蛋白、纖維素等聚合的結(jié)合態(tài)花色苷的溶出；此外，在纖維素酶最適溫度50℃條件提取，花色苷的熱不穩(wěn)定性是低提取率的重要原因.

（2）不同提取方法對花色苷吸收光譜的影響如圖7所示.用酸化乙醇定容后掃描吸收光譜，由圖7可見，藍(lán)莓汁在紫外和可見區(qū)都有吸收，其吸收波長分別為280 nm，538 nm，且在330 nm處存在吸收肩峰，傳統(tǒng)酶法提取物（E）對各組分的含量升高有一定作用，最優(yōu)超聲輔助提取工藝處理后（S）藍(lán)莓汁的吸光度明顯升高，但均沒有形成新的吸收峰.

圖6 不同提取方法對藍(lán)莓花色苷提取率的影響

圖7 不同提取方法對花色苷吸收光譜的影響

（3）不同提取方法花色苷組分比較如圖8所示.本試驗(yàn)對提取前后的提取液樣品分別進(jìn)行HPLC分析.由圖8可見，一方面提取前后花色苷組分種類大致相同，且主要洗脫峰位置無顯著變化，說明提取后并沒有產(chǎn)生新的花色苷衍生物；另一方面與未處理樣品（CK1）相比，最優(yōu)提取條件下獲得的樣品（S）中其主要組分2、3、6和7含量顯著上升，而經(jīng)過酶處理（E）和靜置處理（CK2）樣品中，其主要組分2、4和6含量均有不同程度的下降.

3 討論

超聲波用于花色苷的提取，相比傳統(tǒng)酶法提取而言，超聲提取利用超聲振動能量使細(xì)胞周圍及胞內(nèi)產(chǎn)生環(huán)流，提高細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，提高花色苷提取率12.96%.通過對靜置提取、傳統(tǒng)酶法提取和最優(yōu)條件下超聲輔助熱水提取獲得的藍(lán)莓提取物進(jìn)行全波長掃描發(fā)現(xiàn)沒有新吸收峰出現(xiàn)，初步表明沒有新的衍生物產(chǎn)生.

不同品種或不同產(chǎn)地藍(lán)莓中花色苷種類無太大區(qū)別.Kaisu[7]等在相同洗脫條件下，對藍(lán)莓品種Northblue進(jìn)行HPLC-二極管陣列檢測，發(fā)現(xiàn)了16種花色苷.本試驗(yàn)藍(lán)莓原料含主要的花色苷組分12種.未處理樣各 峰 的 峰 面 積的比例分別 為：tR為 6.104峰 （5.74%），10.526峰（3.28%），11.151 峰（2.46%），13.123峰（16.8%），14.725峰（11.06%），15.201峰（3.68%），17.112峰（6.56%），20.014峰（2.46%），22.989峰（14.34%），25.006峰（25.82%），26.663峰（6.56%），28.648峰（1.23%）.從藍(lán)莓未處理樣色譜圖分析結(jié)果看，圖譜中共有12個組分的峰，這些組分峰構(gòu)成藍(lán)莓最主要的成分花青素.藍(lán)莓花青素主要以飛燕草素、矢車菊素、矮牽牛素等為基本結(jié)構(gòu)，與糖苷中的半乳糖苷、葡萄糖苷和阿拉伯糖苷在不同位點(diǎn)的結(jié)合，衍生出全部含有這三種糖苷而形成各種不同的組分（16種），而圖譜中前11個組分峰面積百分含量占到總量的98.76%，標(biāo)志著藍(lán)莓中的花色苷98.76%的成份是由這些組分構(gòu)成的.本實(shí)驗(yàn)檢測出的12個花色苷組分可能也屬于以上16種花色苷.由于花青素組分的復(fù)雜，有些組分的分子式相同，只是鏈接某些基團(tuán)的位置不同、結(jié)構(gòu)上的微小差異，導(dǎo)致了它們的極性、特性差別非常小.

圖8 不同提取方法花色苷組分比較

4 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)確定藍(lán)莓果漿超聲輔助熱水提取的最佳工藝條件為提取時間119 min，提取溫度69.7℃，超聲時間45 min和稀釋倍數(shù)為7.8，預(yù)測最大提取率58.83±1.78%，在此最優(yōu)條件下，花色苷的提取率為58.64±0.32%，相對誤差僅為0.95%，模型準(zhǔn)確度較高.最優(yōu)超聲輔助熱水提取工藝下花色苷提取率高于傳統(tǒng)酶法提取.HPLC分析結(jié)果表明，最優(yōu)提取工藝下花色苷含量顯著上升，但其主要組分并沒有發(fā)生顯著變化.

目前關(guān)于花色苷的提取、分離純化及鑒定的研究方法很多.超聲輔助提取藍(lán)莓花色苷的方法是一個利用現(xiàn)代物理技術(shù)的試驗(yàn)方法，具有提取率高、工藝簡單、條件溫和等特點(diǎn)，其應(yīng)用前景廣闊.且通過響應(yīng)曲面分析法所獲得的最優(yōu)工藝參數(shù)，能有效減少工藝操作的盲目性，從而為進(jìn)一步試驗(yàn)研究奠定理論基礎(chǔ).

[1]孔祥強(qiáng).談藍(lán)莓中花青素的保健功能[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（15）：130-130.

[2]于東，陳桂星，方忠祥，等.花色苷提取、分離純化及鑒定的研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（3）：127-133.

[3]石光，張春枝，陳莉，等.藍(lán)莓果實(shí)中花色苷提取工藝的研究[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（4）：7-9.

[4]徐懷德，閆寧環(huán)，陳偉，等.黑莓原花色苷超聲輔助提取優(yōu)化及抗氧化研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2008，24（2）：264-269.

[5]KAISU R，LAURA J，SIRPA K，etal.Organ-specific distribution of phenolic compounds in bilberry（Vaccinium myrtillus）and'northblue'blueberry（Vaccinium corymbosum x V.angustifolium）[J].Food Chemistry，2008，110（1）：156-160.

[6]師文添，扶慶權(quán).玫瑰茄中花色苷的超聲波提取工藝研究[J].食品研究與開發(fā)，2010，31（12）：86-89.

[7]張學(xué)寧，高志華，劉慶忠，等.藍(lán)莓花色苷提取工藝的優(yōu)化研究[J].河北工業(yè)科技，2013，30（2）：66-73.