徐全華，單天炎，李忠輝，張 瑩，吳蒙恩

(杭州澳亞生物技術(shù)有限公司，浙江杭州 310018)

注射用丹參多酚酸鹽具有活血、化瘀、通脈功效，用于冠心病穩(wěn)定型心絞痛，中醫(yī)辨證為心血瘀阻證者，癥見胸痛、胸悶、心悸［1］。根據(jù)《中國藥典》2010年版一部無菌檢查法的規(guī)定，建立藥品無菌檢查方法時，應(yīng)該進行方法學(xué)驗證，以證明方法的適用性［2］。目前，還未見注射用丹參多酚酸鹽無菌檢查方法學(xué)驗證的相關(guān)資料，為確保該產(chǎn)品檢查方法科學(xué)、結(jié)果準(zhǔn)確，本文按中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范建立了注射用丹參多酚酸鹽無菌檢查方法，并對方法進行了驗證［3］。

1 儀器與材料

XG1.DWXD－0.36型脈動真空滅菌器(山東新華醫(yī)療器械廠);HTY－Ⅲ型智能集菌儀(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司);KDGB220、KDGB330型一次性全封閉集菌培養(yǎng)器(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司);LRH－250－Ⅱ型、LRH－250型生化培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠)。

注射用丹參多酚酸鹽(規(guī)格:100mg，杭州澳亞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號:12102325、12102425、12110725)。

試驗用菌株:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26 003］;銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)［CMCC(B)10 104］;枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63 501］;生孢梭菌(Clostridium sporogenes)［CMCC(B)64 941］;大腸埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B)44 102］;白色念珠菌(Candida albicans)［CMCC(F)98 001］;黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(F)98 003］。上述菌種由浙江省食品藥品檢驗所提供。

驗證用培養(yǎng)基:硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基;改良馬丁培養(yǎng)基;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基;玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基;改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基由杭州微生物試劑有限公司提供。

稀釋液和沖洗液:0.1%蛋白胨水溶液(杭州澳亞生物技術(shù)有限公司質(zhì)檢部配制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備 取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物，用白金耳接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，取生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物，用白金耳接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，32.5℃培養(yǎng)24 h。取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，25.5℃培養(yǎng)24 h。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)小于100 cfu的菌懸液。

取黑曲霉斜面的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25.5℃培養(yǎng)5 d，使大量孢子成熟，加5 mL含0.05%(mL·mL－1)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，用白金耳輕輕將孢子洗脫，用管口帶紗布的無菌毛細吸管吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%(mL·mL－1)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉注射液制成每1 mL含孢子數(shù)小于100 cfu的孢子懸液。

2.2 菌液計數(shù) 分別取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各1mL于培養(yǎng)皿中，每種菌做兩個平皿，加營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基;取白色念珠菌、黑曲霉菌各1 mL于培養(yǎng)皿中，每種菌做兩個平皿，加玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，按規(guī)定條件培養(yǎng)，結(jié)果見表1。由表1可知，各菌種在相應(yīng)的稀釋度下，每毫升菌落計數(shù)結(jié)果符合規(guī)定。

表1 微生物計數(shù)結(jié)果

2.3 培養(yǎng)基的無菌性試驗 取硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基各8支，在相應(yīng)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)14 d，結(jié)果見表2(注:“+”代表有菌生長，“—”代表無菌生長，以下表格符號意義相同)。由表2可知，二種培養(yǎng)基的無菌性符合規(guī)定。

2.4 培養(yǎng)基的靈敏度試驗 取每管裝量為12 mL的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另一支不接種作為空白對照，按相應(yīng)的條件培養(yǎng)3 d。每管裝量為9 mL的改良馬丁培養(yǎng)基5支，分別接種小于100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另一支不接種作為空白對照，按相應(yīng)的條件培養(yǎng)5 d。每天觀察記錄，結(jié)果見表3。由表3可知，培養(yǎng)基的靈敏度試驗結(jié)果符合規(guī)定。

2.5 薄膜過濾法方法學(xué)驗證［4－8］每批取供試品180支，每支用0.1%蛋白胨緩沖液5 mL溶解，每10支為一組，分成18組，每組使用一個過濾器，其中6組未用沖洗液沖洗，另6組沖洗量為100 mL，再6組沖洗量為300 mL，在最后一次沖洗液中加入每1 mL小于100 cfu的試驗菌1 mL，過濾后，將相應(yīng)的培養(yǎng)基100 mL加至各濾筒內(nèi)作為供試品陽性對照(PPC)。另取集菌培養(yǎng)器，不過濾供試品，其它操作同上，作為陽性對照(PC)。按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d，各試驗菌同法操作，結(jié)果見表4、表5、表6。由表4～表6可知，三批產(chǎn)品在設(shè)定沖洗量為未沖洗、100 mL和300 mL條件下，對6種菌株而言供試品陽性對照和陽性對照均生長良好，并且無明顯差異，均無抑菌作用，因此，確定該產(chǎn)品無菌檢查方法為:取本品，用0.1%蛋白胨水溶液溶解，采用薄膜過濾法過濾，無需經(jīng)沖洗液沖洗，直接加相應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.6 樣品的無菌檢查 每批取供試品30支，每支用0.1%蛋白胨水溶液5 mL溶解，取三聯(lián)管全封閉集菌培養(yǎng)器直接過濾，其中一管加入100 mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，另一管加入100 mL改良馬丁培養(yǎng)基，第三管加入100 mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基并接種小于100 cfu的金黃色葡萄球菌菌液作供試品陽性對照，另取稀釋液，同法操作，作為陰性對照，按規(guī)定溫度培養(yǎng)14 d，結(jié)果見表7。由表7可知，三批產(chǎn)品按驗證確定的方法進行檢查，供試品陽性對照和陰性對照均成立，產(chǎn)品符合無菌要求。

表2 培養(yǎng)基的無菌性檢查結(jié)果

表3 培養(yǎng)基的靈敏度試驗結(jié)果

表4 注射用丹參多酚酸鹽方法學(xué)驗證結(jié)果(批號:12102325)

表5 注射用丹參多酚酸鹽方法學(xué)驗證結(jié)果(批號:12102425)

表6 注射用丹參多酚酸鹽方法學(xué)驗證結(jié)果(批號:12110725)

表7 樣品無菌檢查試驗結(jié)果

3 討論

根據(jù)《中國藥典》二部附錄Ⅺ無菌檢查法的要求，無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法，只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過濾法，因此，本品采用薄膜過濾法進行了相應(yīng)的研究。此外，由于注射用丹參多酚酸鹽為非抗菌藥物，因此，選擇金黃色葡萄球菌作陽性對照菌。研究結(jié)果表明:注射用丹參多酚酸鹽在試驗菌液計數(shù)及所用培養(yǎng)基無菌性、靈敏度符合規(guī)定條件下，三批產(chǎn)品未經(jīng)沖洗、以及沖洗量為100 mL和300 mL三組之間供試品陽性對照組生長情況與陽性對照組生長情況一致，表明該產(chǎn)品無抑菌和干擾作用。三批樣品經(jīng)檢查，符合無菌要求。因此，確定該產(chǎn)品無菌檢查方法為:取本品30支，每支用0.1%蛋白胨水溶液5 mL溶解，用薄膜過濾法處理后，依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。通過上述驗證所建立的方法可用于注射用丹參多酚酸鹽的無菌檢查，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

［1］ 宋燕青，徐向陽，孫仁弟.注射用丹參多酚酸鹽的臨床應(yīng)用概述［J］.藥物流行病學(xué)雜志，2012，21(8):404 －406.

［2］ 國家藥典委員會.中國藥典:一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄76 －79.

［3］ 中國藥品生物制品檢定所，中國藥品檢驗總所.中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:337－351.

［4］ 陳曉寧.注射用七葉皂苷鈉無菌檢查方法學(xué)驗證［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，8(1):48 －49.

［5］ 許 威，李 翔.氟羅沙星注射液無菌檢查方法的探討［J］.安徽醫(yī)藥，2011，15(10):1228 －1229.

［6］ 江志杰，高 春.三種中藥注射劑無菌檢查方法的建立和結(jié)果評價［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2013，7(3):15 －17.

［7］ 閔 紅，裴小龍，楊曉莉.三種規(guī)格注射用頭孢地嗪鈉無菌方法學(xué)驗證［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(5):764 －766.

［8］ 吳 煒.羥乙基淀粉(200/0.5)乳酸鈉林格注射液無菌檢查方法學(xué)驗證［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(8):1300 －1302.