高志榮，趙艷艷，張洪斌，崔云龍，曹明成

(1.合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)院;2.合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽合肥 230009;3.合肥創(chuàng)新醫(yī)藥技術(shù)有限公司，安徽 合肥 230088)

甘油磷酸膽堿(Glycerophosphatidylcholine，GPC，alpha-GPC)是脂磷脂酰膽堿(PC)分子上的兩個(gè)脂肪酰基完全被水解掉的產(chǎn)物。藥物代謝動(dòng)力學(xué)表明:PC被吸收進(jìn)入血液循環(huán)，分布在各器官，它也是人體內(nèi)分泌代謝的水溶性小分子物質(zhì)，能通過(guò)血腦屏障，為重要的神經(jīng)傳遞質(zhì)乙酰膽堿(Acetylcholine)的生物合成前體［1－2］。根據(jù)“膽堿能損傷假說(shuō)”［3］，老年癡呆癥的發(fā)病機(jī)制(記憶力、認(rèn)知障礙等)與神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿水平降低密切相關(guān)，如果提高腦內(nèi)乙酰膽堿水平，可以顯著改善老年癡呆患者認(rèn)識(shí)功能損傷的癥狀。有專利報(bào)道了甘油磷酸膽堿和茴拉西坦同時(shí)服用，可以治療阿爾茨海默氏癥［4］。臨床研究表明:GPC治療腦缺血性中風(fēng)［5］、阿爾茨海默氏癥［6］、多發(fā)性腦梗死型癡呆［7］療效顯著。臨床用于改善中毒性肝損傷等保肝作用［8］;同時(shí)，GPC 還具有顯著的防衰老、降血脂、健腦等多種功效，作為保健品及藥物制劑的研究與應(yīng)用正越來(lái)越受到重視。GPC已經(jīng)在意大利、波蘭、韓國(guó)、俄羅斯、希臘、智利、巴西等國(guó)家上市，可在我國(guó)，還處于研發(fā)階段。本試驗(yàn)，采用三氧化二鋁脫色法［9］和硅膠柱層析法［10］相結(jié)合的工藝對(duì)甘油磷酸膽堿進(jìn)行分離純化，并采用高效液相色譜法對(duì)其在強(qiáng)光照射、高溫、高濕等條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，從而為其生產(chǎn)、包裝、貯存、制劑研發(fā)等提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司SL202N型電子天平;長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司TG16－WS臺(tái)式高速離心機(jī);江蘇金壇晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠HH－2型恒溫水浴鍋;美國(guó)ALLTECH2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，配備單島津液相LC－10ATVP輸液泵，六通閥手動(dòng)進(jìn)樣，浙江大學(xué)N2000色譜工作站。

1.2 主要試藥 GPC粗品由合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室酶法生產(chǎn);GPC對(duì)照品從意大利Euticals S.pA公司購(gòu)買;GPC產(chǎn)品(批號(hào)為100301，100302，100303)由本實(shí)驗(yàn)室分離純化制得。無(wú)水乙醇、甲醇、二氯甲烷均為天津四友公司生產(chǎn)的分析純?cè)噭?，乙腈為天津四友公司生產(chǎn)的色譜純?cè)噭?，所用水為超純水機(jī)制備的去離子水;三氧化二鋁和硅膠粉均為100～200目，由國(guó)藥集團(tuán)生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘油磷酸膽堿的層析純化

2.1.1 三氧化二鋁和硅膠粉的預(yù)處理 三氧化二鋁的預(yù)處理:將三氧化二鋁平鋪在容器中，于250℃的烘箱中烘烤4 h待用;硅膠粉的預(yù)處理:將硅膠粉平鋪在容器中，于105℃的烘箱中烘烤30 min待用。

2.1.2 三氧化二鋁對(duì)甘油磷酸膽堿粗品脫色 選擇甘油磷酸膽堿與三氧化二鋁的質(zhì)量比為1∶10。在燒杯中稱取實(shí)驗(yàn)室制備的甘油磷酸膽堿約10 g，加入無(wú)水乙醇約100 mL，置于50℃的恒溫水浴鍋中保溫，攪拌，使得甘油磷酸膽堿完全溶解后，加入約100 g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的三氧化二鋁，攪拌脫色2 h，離心分離，除去下層三氧化二鋁。將上層溶液蒸發(fā)濃縮除去溶劑，得到塑黃色的甘油磷酸膽堿4.2 g。

2.1.3 硅膠柱層析法進(jìn)一步純化甘油磷酸膽堿稱取約210 g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的硅膠粉，用甲醇溶脹24 h后，濕法裝柱。將經(jīng)過(guò)三氧化二鋁脫色的4.2 g甘油磷酸膽堿產(chǎn)品溶于少量乙醇中，小心的加入層析柱內(nèi)。緩慢的加入洗脫劑(甲醇∶乙醇∶氯仿=60∶35∶15)進(jìn)行洗脫，分段收集柱下端流出的洗脫液，檢測(cè)，合并含有甘油磷酸膽堿的洗脫液，蒸發(fā)濃縮除去溶劑，得到甘油磷酸膽堿產(chǎn)品。

2.2 甘油磷酸膽堿的含量測(cè)定及穩(wěn)定性研究

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取意大利Euticals S.pA公司的GPC對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，得到約10 g·L－1的儲(chǔ)備液，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 色譜條件 浙江大學(xué)N2000工作站，色譜柱為 GraceSmart RP C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為60%乙腈—水溶液，流速為 0.7 mL·min－1，柱溫為(25±1)℃。檢測(cè)器為美國(guó)Alltech 2000型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管溫度為109℃，載氣為空氣，氣體流速為 3.5 mL·min－1，進(jìn)樣量為 20 μL。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 分別精密吸取GPC對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、3、5、10、20 mL，置于 100 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相定容后，搖勻。精密量取20 μL進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。對(duì)進(jìn)樣濃度(mg·L－1)和峰面積分別取對(duì)數(shù)，然后以濃度的對(duì)數(shù)lnC對(duì)甘油磷酸膽堿峰面積的對(duì)數(shù)Y進(jìn)行線性回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=0.538 1lnC －8.722，R2=0.999，線性范圍為100～2 000 mg·L－1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

通過(guò)圖1可以看出，硅膠柱層析后GPC在圖譜上表現(xiàn)為單峰。無(wú)論是從外觀上還是從HPLC譜圖上分析，都可以得出結(jié)論:通過(guò)硅膠柱層析能夠得到GPC純品。

2.2.4 樣品含量測(cè)定方法 精密稱取經(jīng)過(guò)分離純化的GPC適量，用流動(dòng)相溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，得到約10 g·L－1的溶液。精密量取該溶液5 mL，置于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻。精密量取20 μL進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，并采用外標(biāo)兩點(diǎn)對(duì)數(shù)法計(jì)算樣品含量。

2.2.5 回收率試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液3、10 mL，置于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容后，搖勻，作為對(duì)照品溶液。精密稱取分離純化的GPC(批號(hào)100301)適量，用流動(dòng)相溶解，分別制成約含GPC 0.4、0.5、0.6 g·L－1的溶液各3 份。精密量取20 μL進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。采用外標(biāo)兩點(diǎn)對(duì)數(shù)法計(jì)算含量，并求得回收率。

平均回收率為 99.81%;RSD=0.85%(n=9)。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.2.6 精密度試驗(yàn) 對(duì)照品溶液取“2.2.5”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液。精密稱取分離純化的GPC產(chǎn)品(批號(hào)100301)適量，用流動(dòng)相溶解，制成約含GPC 0.5 g·L－1的溶液。精密量取20 μL進(jìn)樣，進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積。采用外標(biāo)兩點(diǎn)對(duì)數(shù)法計(jì)算樣品含量，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果測(cè)得GPC的含量分別為:99.02%、99.67%、100.14%、100.18%、99.28%、99.95%，平均含量為 99.71%，RSD=0.48%(n=6)。

2.2.7 強(qiáng)光照射試驗(yàn)［11］取分離純化的GPC(批號(hào)100301)3份，編號(hào)為 100301－1、100301－2、100301－3，分別平鋪在培養(yǎng)皿中，使其厚度≤5 mm，置于澄明度測(cè)定儀下(光線強(qiáng)度為4 500 LX)10 d，于第5、10天取樣，與第0天的含量比較，考察其含量變化。平均含量為99.51%;RSD=0.40%(n=9)，結(jié)果表明含量無(wú)明顯變化，即GPC對(duì)光比較穩(wěn)定。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 強(qiáng)光照射試驗(yàn)結(jié)果%

2.2.8 高溫試驗(yàn) 取分離純化的 GPC(批號(hào)100301)3份，編號(hào)為100301－1、100301－2、100301－3，分別平鋪在培養(yǎng)皿中，使其厚度≤5 mm，在60℃下放置10 d，于第5、10天取樣，與第0天的含量比較，考察其含量變化。計(jì)算平均含量為99.65%，RSD 為0.42%(n=9)，結(jié)果說(shuō)明含量無(wú)明顯變化，表明GPC原料藥對(duì)熱比較穩(wěn)定。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 高溫試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 高濕試驗(yàn)［12］取分離純化的 GPC(批號(hào)100301)三份，編號(hào)為 100301－1、100301－2、100301－3，分別平鋪在培養(yǎng)皿中，使其厚度≤5 mm，在25℃于相對(duì)濕度75%條件下放置10 d，于第5、10天取樣，與第0天的含量比較，考察其含量變化。試驗(yàn)結(jié)果:平均含量為99.30%，RSD為0.47%(n=9)，表明GPC對(duì)濕比較穩(wěn)定。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 高濕試驗(yàn)結(jié)果

2.2.10 加速試驗(yàn) 分別取 GPC(批號(hào)為100301、100302、100303)各一份，在密閉器皿中于40℃、相對(duì)濕度75%的條件下放置6個(gè)月，于第1、2、3、6個(gè)月月末取樣，與第0個(gè)月的含量比較，考察其含量的變化。計(jì)算含量平均值為99.61%，RSD為0.57%(n=15)，結(jié)果含量無(wú)明顯變化，表明 GPC比較穩(wěn)定。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 加速試驗(yàn)結(jié)果

2.2.11 長(zhǎng)期試驗(yàn) 分別取 GPC(批號(hào)為100301、100302、100303)各一份，在密閉器皿中于25℃，相對(duì)濕度60%的條件下放置12個(gè)月，于第3、6、9、12個(gè)月月末取樣，與第0個(gè)月的含量比較，考察其含量的變化。平均含量為99.12%，RSD為0.50%(n=15)，即含量無(wú)明顯變化，表明GPC化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)比較穩(wěn)定。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 長(zhǎng)期試驗(yàn)結(jié)果

2.2.12 重復(fù)性試驗(yàn) 取配制5份濃度為0.5 g·L－1的 GPC 供試品溶液，按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按照上述含量測(cè)定方法，測(cè)得5份GPC供試品的含量分別為99.83%、100.11%、99.92%、98.57%、99.98%，計(jì)算 RSD 為0.63%。結(jié)果表明本法測(cè)定的重復(fù)性良好。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)三氧化二鋁脫色法和硅膠柱層析法相結(jié)合的工藝對(duì)甘油磷酸膽堿進(jìn)行分離純化，能夠得到含量達(dá)99.5%以上的產(chǎn)品。該分離純化工藝簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。采用美國(guó)Alltech2000型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，使用高效液相色譜法研究甘油磷酸膽堿的穩(wěn)定性，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，GPC色譜峰的理論塔板數(shù)均在3000以上。該方法靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。通過(guò)影響因素試驗(yàn)、加速試驗(yàn)和長(zhǎng)期試驗(yàn)考察后，甘油磷酸膽堿的性狀沒(méi)有發(fā)生明顯改變，且產(chǎn)品的各項(xiàng)指標(biāo)均符合中國(guó)藥典2010版的規(guī)定，產(chǎn)品的穩(wěn)定性良好。

實(shí)事上，甘油磷酸膽堿在意大利LPB公司上市，臨床應(yīng)用多年，臨床效果顯著。流行病學(xué)調(diào)查［13］，我國(guó)老年癡呆患者約600萬(wàn)左右，目前尚無(wú)特效治療藥物，研發(fā)治療相關(guān)疾病新藥是當(dāng)務(wù)之急。根據(jù)國(guó)家FDA新藥標(biāo)準(zhǔn)，甘油磷酸膽堿可以做為“只要該活性成分未被批準(zhǔn)上市”新藥研究開(kāi)發(fā)。有關(guān)研究表明，新化學(xué)實(shí)體研發(fā)失敗的原因主要?dú)w結(jié)為以下3個(gè)方面:安全性、有效性和經(jīng)濟(jì)性［14］。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)以大豆磷脂為原料制備甘油磷酸膽堿進(jìn)行了深入研究，采用非水相生物催化制備甘油磷酸膽堿［15］，生物催化反應(yīng)所用試劑毒性小，且有高度專一性，且不改變卵磷脂的天然結(jié)構(gòu)，反應(yīng)條件溫和，該工藝經(jīng)濟(jì)、安全、環(huán)保，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

進(jìn)一步對(duì)甘油磷酸膽堿的鑒別和含量測(cè)定方法進(jìn)行了探索，采用化學(xué)鑒別法、薄層色譜鑒別法、HPLC鑒別法和紅外色譜圖鑒別法，能夠簡(jiǎn)便、可靠、真實(shí)、有效地對(duì)甘油磷酸膽堿進(jìn)行鑒別。所采用的HPLC－ELSD含量檢測(cè)法，專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性高，可作為三類新藥GPC的含量標(biāo)準(zhǔn)控制［16］。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)室以大豆磷脂為原料，采用科學(xué)、先進(jìn)的酶法制備和純化GPC的工藝，使產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到申報(bào)國(guó)家新藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在強(qiáng)光照射、高溫、高濕等條件下的穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，甘油磷酸膽堿的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，從而為其生產(chǎn)、包裝、貯存、制劑研發(fā)等提供了科學(xué)依據(jù)。

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