王前 佟乃興 劉燁華（大連華信理化檢測中心有限公司）

生活飲用水及其水源水等水體受到生活污水、工農(nóng)業(yè)廢水或人和動(dòng)物糞便的污染后，水中的細(xì)菌數(shù)量可大量增加，其中病原菌也隨之增加，引發(fā)傳染，危害人類健康，因而水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌數(shù)量可反映水體受微生物污染的程度。水中細(xì)菌總數(shù)往往同水體受有機(jī)物污染的程度呈正相關(guān)。故水的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)對(duì)了解水體被污染的程度，在流行病學(xué)和提供水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中具有重要意義和價(jià)值，它是評(píng)價(jià)水質(zhì)污染程度的重要指標(biāo)之一。

我們采用平板計(jì)數(shù)法，檢驗(yàn)水中的細(xì)菌總數(shù)，細(xì)菌總數(shù)是指1mL水樣在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于37℃經(jīng)24h培養(yǎng)后，所生長的細(xì)菌菌落的總數(shù)（CFU）。在實(shí)驗(yàn)過程中根據(jù)相關(guān)規(guī)定，每次實(shí)驗(yàn)必須由同一實(shí)驗(yàn)人員，進(jìn)行平行樣測定，因此，我們采用同一陽性水樣，做15份平行樣，對(duì)水質(zhì)中細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行平行樣評(píng)定。但這個(gè)過程中一定會(huì)存在無法避免的誤差，即不確定度，本實(shí)驗(yàn)在此對(duì)水質(zhì)中細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)中不確定度進(jìn)行評(píng)定。

一、實(shí)驗(yàn)材料與依據(jù)

1.1 測試樣品：

以正規(guī)采樣方法采集的，已確定為陽性的水樣。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）

稀釋水：超純水裝置制備的純化水，經(jīng)121℃，高壓滅菌15min，冷卻至室溫

定量移液管、90cm培養(yǎng)皿、250ml錐形瓶

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

超凈工作臺(tái) 型號(hào)：BCN-1360B，生產(chǎn)廠家：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司

恒溫培養(yǎng)箱 型號(hào)：HPP-9272，生產(chǎn)廠家：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司

鼓風(fēng)干燥箱 型號(hào)：HPG-9245，生產(chǎn)廠家：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司

高壓滅菌鍋 型號(hào)：ES315，生產(chǎn)廠家：日本Tomy

超純水裝置 型號(hào)：611UF，生產(chǎn)廠家：賽多利斯

1.4 實(shí)驗(yàn)依據(jù)

《水和廢水監(jiān)測分析方法》第四版，細(xì)菌總數(shù)的測定B（P694），

二、實(shí)驗(yàn)方法：

2.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

2.2.1 實(shí)驗(yàn)前，先將實(shí)驗(yàn)用器具用高壓滅菌鍋以121℃，20min滅菌，并用鼓風(fēng)干燥箱烘干；

2.2.2 超凈工作臺(tái)無菌操作區(qū)域臺(tái)面，用75%酒精擦拭；實(shí)驗(yàn)前紫外照射20mins，開啟風(fēng)機(jī)10mins，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作過程中保持風(fēng)機(jī)開啟；

2.2.3 確認(rèn)實(shí)驗(yàn)用儀器設(shè)備在檢定周期范圍內(nèi)，同時(shí)可以正常使用；

2.2.4 確認(rèn)水樣為陽性，同時(shí)并確認(rèn)菌落范圍，原水樣菌落數(shù)超出300，稀釋10倍后菌落數(shù)在30～300之間；

2.2.5 以無菌操作，準(zhǔn)備15份水樣。

2.2 實(shí)驗(yàn)操作

2.2.1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基滅菌后，自然冷卻，在溫度在50℃左右時(shí)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；

2.2.2 以無菌操作的方式，取1ml水樣置于已滅菌的培養(yǎng)皿中，倒入15～20ml，45℃左右的營養(yǎng)瓊培養(yǎng)基，立即旋搖（不能將培養(yǎng)基搖到平皿外）充分混勻；一份樣品要做平行樣對(duì)照；

2.2.3 待營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，底面朝上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

2.2.4 培養(yǎng)24小時(shí)后，去除平皿，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

2.3 數(shù)據(jù)模型

細(xì)菌總數(shù)=A××fn

式中：A培養(yǎng)后細(xì)菌總數(shù) cfu/ml；

fn為樣品的稀釋倍數(shù)；

三、結(jié)果與討論

3.1 稀釋倍數(shù)不確定度分量：

根據(jù)方法要求，取1ml水樣加入到9ml無菌水中，以稀釋樣逐級(jí)稀釋；此間使用定量移液管，根據(jù)校準(zhǔn)證書，查看10ml、1ml分度吸管誤差可計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為u1=±0.05、u2=±0.007；

3.2 菌落數(shù)計(jì)數(shù)不確定度

根據(jù)檢測方法的要求，培養(yǎng)15份稀釋樣品平行測定陽性水樣結(jié)果，進(jìn)行對(duì)數(shù)分析：

序號(hào)Log值2.031 2.151 2.116 2.100 2.125 2.099 2.111 2.114 2.083 2.035 2.079 2.157 2.130 2.097 2.104 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0平皿1 105 135 125 134 127 125 125 126 117 114 131 134 119 110 136 Log值2.019 2.130 2.097 2.125 2.102 2.097 2.095 2.100 2.068 2.057 2.116 2.125 2.076 2.041 2.132平皿2 108 142 131 126 134 126 129 130 121 109 120 144 135 125 127 11 12 13 14 15 S2 0.00007555 0.00020854 0.00017485 0.00031527 0.00027356 0.00000150 0.00011889 0.00009211 0.00010657 0.00023059 0.00066355 0.00049206 0.00150080 0.00154109 0.00039581

所有菌落數(shù)的平均值，A平均=125 cfu/ml。

3.3 合成相對(duì)不確定度

3.4 不確定度評(píng)定結(jié)果

按照方法進(jìn)行分析測定，擴(kuò)展不確定度中，取擴(kuò)展因子K=2，U(C)=10×2=20，即利用平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)水中細(xì)菌總數(shù)，不確定度評(píng)定結(jié)果為細(xì)菌總數(shù)=125±20 cfu/ml。

[1]國家環(huán)境保護(hù)總局，水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）[M]，細(xì)菌總數(shù)的測定（P694），2002：694-697.

[2]JJF 1059-2012，測量不確定度評(píng)定與表示[S].