江 海 李 斌 魏遠(yuǎn)福 王 波

食管癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是影響術(shù)后患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。nm23 是一種抑制腫瘤轉(zhuǎn)移基因，其主要通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞的分化、參與免疫防御，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、分化和侵襲轉(zhuǎn)移［1］。E-cadherin 是一種細(xì)胞黏附分子，有研究表明E-cadherin 低表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［2］。

本研究采用免疫組織化學(xué)S-P 法檢測(cè)nm23 和E-cadherin蛋白的表達(dá)，探討其與食管鱗癌的發(fā)生、分化程度、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，從而進(jìn)一步探討E-cadherin 蛋白與nm23 蛋白之間的相關(guān)性，為預(yù)測(cè)食管鱗癌的轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料 選取2010 年1 月～20012 年7 月期間在鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除且術(shù)前均未接受過(guò)放療、化療及免疫治療的食管癌標(biāo)本68 例，其中女性30 例，男性38例，年齡35～78 歲，中位年齡56.5 歲。低分化鱗癌14 例，中分化鱗癌29 例，高分化鱗癌25 例;無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鱗癌30例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鱗癌38 例;有纖維膜浸潤(rùn)的鱗癌56 例，無(wú)纖維膜浸潤(rùn)的鱗癌12 例。同時(shí)取距腫瘤5cm 的正常食管黏膜組織23 例作對(duì)照。

1.2 方法 選取的食管鱗癌組織和正常食管黏膜組織行常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，厚4μm，分別作HE 染色﹑免疫組化和陰性對(duì)照用。采用免疫組化技術(shù)(S-P 法)對(duì)各組標(biāo)本中的E-cadherin 和nm23 進(jìn)行檢測(cè)，鼠抗人nm23 單克隆抗體、鼠抗人E-cadherin 單克隆抗體及鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，鼠抗人nm23 單克隆抗體和鼠抗人E-cadherin 單克隆抗體均采用微波修復(fù)抗原，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用PBS 代替一抗作陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 nm23 結(jié)果判定:根據(jù)參考文獻(xiàn)［3］nm23 蛋白陽(yáng)性表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)和/或細(xì)胞膜上棕黃色顆?；驁F(tuán)塊，結(jié)果以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分比來(lái)表示，按照美國(guó)Sabina signiretti判斷標(biāo)準(zhǔn)，每張切片由兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生觀察10 個(gè)具有代表性的高倍視野，每個(gè)高倍視野記數(shù)200 個(gè)腫瘤細(xì)胞，按照鏡下陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分率綜合判斷，以腫瘤細(xì)胞中著色細(xì)胞的百分率來(lái)表示＜10%記為陰性(-)，＞25%記為陽(yáng)性(+)。

1.3.2 E-cadherin 結(jié)果判定:根據(jù)參考文獻(xiàn)［4］的方法，以細(xì)胞膜呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。對(duì)每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞，共計(jì)1000 個(gè)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞并計(jì)算其所占比例:陽(yáng)性細(xì)胞＜25%，判定為陰性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞＞25%，判定為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)及配對(duì)χ2相關(guān)分析，t檢驗(yàn)、方差分析(F 檢驗(yàn))，以a=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，當(dāng)P ＜0.05 時(shí)表明在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性意義，P ＞0.05 為差別無(wú)顯著性意義。統(tǒng)計(jì)工具應(yīng)用SAS6.12 統(tǒng)計(jì)軟件包。

2.結(jié)果

2.1 nm23 免疫組化檢測(cè)結(jié)果 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示(表1):nm23 正常食管組織中和在食管鱗癌陽(yáng)性表達(dá)率分別是93.3%(28/30)及75%(35/68)，兩組間具有顯著性差異(P ＜0.05)。nm23 在高、中及低分化食管鱗癌組織中陽(yáng)性率分別為52%(13/25)，51.7%(15/29)和50%(7/14)，三組之間差異無(wú)顯著性意義(P ＞0.05)。nm23 在有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別是52.7% (20/38)及36.7%(11/30)，兩組間具有顯著性差異(P ＜0.05)。nm23在食管鱗癌組織中有、無(wú)浸潤(rùn)至纖維膜中的陽(yáng)性表達(dá)率分別是75%(42/56)及41.7%(5/12)，兩組間具有顯著性差異(P ＜0.05)。

表1 nm23 在食管鱗狀細(xì)胞癌和正常食管黏膜組織中的表達(dá)

2.2 E-cadherin 免疫組化檢測(cè)結(jié)果 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示(見(jiàn)表2):E-cadherin 蛋白在正常的食管鱗狀上皮組織中以基底層細(xì)胞和棘層細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng)。E-cadherin 蛋白在食管鱗癌和正常食管組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別是69.1%(47/68)及100%(30/30)，兩組間具有顯著性差異(P ＜0.05)。E-cadherin 蛋白在高、中、低分化的癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率分別為84%(21/25)，72.4%(21/29)和51.1%(8/14)，結(jié)果顯示Ecadherin 蛋白在食管鱗癌組織的不同分化程度中的表達(dá)有明顯差異(P ＜0.05)。E-cadherin 蛋白在有、無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移的癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為57.9%(22/38)和80%(24/30)，二者的陽(yáng)性表達(dá)率差別有顯著意義(P ＜0.05)。E-cadherin 蛋白在有、無(wú)纖維膜浸潤(rùn)的食管鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為71.4%(40/56)和66.7%(8/12)，二者的陽(yáng)性表達(dá)率差別無(wú)顯著意義(P ＞0.05)。

2.3 nm23 與E-cadherin 的關(guān)系 食管癌組織中nm-23的表達(dá)與E-cadherin 的表達(dá)呈正相關(guān)(P ＜0.05，表3)，提示nm-23 與E-cadherin 在促進(jìn)食管癌的分化，抑制食管癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移中，可能有正向調(diào)節(jié)的協(xié)同作用。

表2 E-Cadherin 在食管鱗狀細(xì)胞癌和正常食管黏膜組織中的表達(dá)

表3 nm23 和E-Cadherin 在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)的相互關(guān)系

3.討論

1988 年美國(guó)國(guó)立癌癥研究所的steeg 等，應(yīng)用差異雜交(differential hybridization)等技術(shù)從小鼠黑色素瘤k-1735 細(xì)胞株中分離出腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23［5］。目前多研究表明，在乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌等腫瘤中nm23 的表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)密切［6，7］。Nm23 可能通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白或基因的調(diào)控而抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［8］。同時(shí)也通過(guò)改變腫瘤細(xì)胞骨成分結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，從而抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［9］。

本研究研究發(fā)現(xiàn)，nm23 在食管鱗癌組織中的表達(dá)低于正常組織，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示nm23 的低表達(dá)可能與食管癌的發(fā)生有關(guān)。nm23 在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的食管癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示nm23 的低表達(dá)可能與食管鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)。nm23 在無(wú)纖維膜浸潤(rùn)的食管癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于有纖維膜浸潤(rùn)組，提示nm23 的低表達(dá)可能與食管鱗狀細(xì)胞癌的浸潤(rùn)有關(guān)。其表明nm23 表達(dá)降低，機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制力減低，使其更易向周?chē)M織浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。

E-cadherin 是維持細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性和極性的Ca2+依賴(lài)性跨膜糖蛋白。有研究表明，當(dāng)腫瘤細(xì)胞的E-鈣黏附素發(fā)生基因突變、轉(zhuǎn)錄受抑、啟動(dòng)子區(qū)域GpG 高度甲基化或翻譯紊亂時(shí)，其功能發(fā)生障礙，而使腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲性生長(zhǎng)，同時(shí)是腫瘤細(xì)胞分化程度降低及易脫離原發(fā)灶而發(fā)生局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［10］。本研究表明食管癌中存在明顯的E-cadherin 表達(dá)缺失或表達(dá)水平的降低(P ＜0.05)，從蛋白水平上證明了E-cadherin 基因的失活與食管癌的發(fā)生有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)伴無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織E-cadherin 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P ＜0.05)，低分化的癌組織Ecadherin 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于高分化的癌組織(P ＜0.05)，這說(shuō)明E-cadherin 表達(dá)的減少與食管鱗癌分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示食管鱗狀細(xì)胞癌組織中nm-23 的表達(dá)與E-cadherin 的表達(dá)呈正相關(guān)(P ＜0.05)，提示E-cadherin 與nm-23 在抑制食管癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移中，以及促進(jìn)食管癌的分化中，可能有正向調(diào)節(jié)的協(xié)同作用，共同抑制食管鱗癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，兩者表達(dá)水平的增高可能共同抑制淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，但這并不能說(shuō)明nm23 能夠促進(jìn)E-cadherin 的表達(dá)，其具體作用機(jī)制目前尚不太清楚，nm-23 與E-cadherin 的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。

1 Steeg PS.Perspectives on classic article:metastasis suppressor genes［J］.J Natl Cancer Inst，2004，96(6):E4.

2 Shiozaki H，Doki Y，Yamana H，et al.A multi-institutional study of immunohistochemical investigation for the roles of cyclin D1 and E-cadherin in superficial squamous cell carcinoma of the esophagus［J］.Journal of Surgical Oncology，2002，79:166 -173.

3 Steeg PS.Perspectives on classic article:metastasis suppressor genes［J］.J Natl Cancer Inst，2004，96(6):E4.

4 Kawasaki H，Altieri DC，Lu CD，et al.Inhibition of apoptosis by survivin predicts shorter survival rates in colorectal cancer［J］.Cancer Research，1998，58(22):5071 -5074.

5 Steeg PS，Bevilacqua G，Kopper L，et al.Evidence for a novel gene associated with low tumor-metastatic potential［J］.J Natl Cancer Inst，1988，80:200 -203.

6 Dursun A，Akyorek N，Gonel N，et al.GPrognostic implication of nm23-H1 expression in colorectal carcinomas［J］.The Journal of Pathology，2002，34(5):427 -432.

7 Lee JH，Marshall JC，Steeg PS，et al.Altered gene and protein expression by Nm23-H1 in metastasis suppression［J］.Molecular and Cellular Biochemistry，2009，329(1 -2):141 -148.

8 聶強(qiáng)，周清華，朱文.nm23-H1 通過(guò)下調(diào)PKC 信號(hào)通路抑制肺癌細(xì)胞侵襲［J］.中華腫瘤雜志，2006，28(5)，334 -336.

9 Murakami M Meneses PI，Knight JS，et al，Nm23-H1 modu-lates the activity of the guanine exchange factor Dbl-1［J］.International Journal of Cancer，2008，123(3):500 -510.

10 Berx G，Staes K，van Hengel J，Molemans F，Bussemakers MJ，van Bokhoven A，van Roy F.Cloning and Characterization of human invasion suppressor gene E-cad(CDH 1)［J］.Genomiccs，1995，26:281.