丁小杰 魏大鵬 陳菊萍

Nutlin-3對人A375黑素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及可能機(jī)制

丁小杰 魏大鵬 陳菊萍

目的觀察順式咪唑啉衍生物nutlin-3對人A375黑素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,研究其機(jī)制。方法將A375細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對照組,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞接受2.5、5、10 μmol/L nutlin-3處理,對照組細(xì)胞采用二甲基亞砜處理。分別于作用24、48、72 h后,噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞增殖情況;Western印跡檢測p53蛋白表達(dá)的改變;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布以及細(xì)胞凋亡;Transwell法檢測遷移性變化。采用重復(fù)測量的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)。結(jié)果2.5、5、10 μmol/L nutlin-3處理A375細(xì)胞24、48、72 h后,MTT法顯示不同時間點(diǎn)間的增殖抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=67.43,P＜0.01),不同濃度間的抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=135.58,P＜0.01),濃度越高抑制率越高;時間和濃度之間有交互作用(F=26.95,P＜0.01)。Western印跡、流式細(xì)胞儀、Transwell法檢測顯示,不同時間點(diǎn)之間A375細(xì)胞的p53表達(dá)、G2期細(xì)胞百分率、凋亡率、遷移抑制率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為1255.00、831.38、809.45、1100.00,均P＜0.01),除p53外,時間越長各項(xiàng)指標(biāo)值越高;不同濃度間各項(xiàng)指標(biāo)值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為9196.00、267.99、723.83、1667.00,均P＜0.01),濃度越高各項(xiàng)指標(biāo)值越高;時間與濃度之間交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為826.79、21.602、44.48、313.09,均P＜0.01)。結(jié)論Nutlin-3可能通過p53蛋白積累途徑抑制人A375細(xì)胞的增殖和遷移,促進(jìn)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡。

nutlin-3;黑色素瘤,實(shí)驗(yàn)性;細(xì)胞周期;細(xì)胞凋亡;細(xì)胞運(yùn)動

抑癌基因p53在保護(hù)遺傳穩(wěn)定性中起關(guān)鍵的作用。由紫外線引起的p53突變在黑素瘤中很罕見,只是其表達(dá)處于低水平,這是因?yàn)殡p微體基因-2(double minute 2,嚙齒類為MDM2,人類為HDM2)編碼的產(chǎn)物與p53蛋白結(jié)合[1],促進(jìn)p53蛋白降解。Nutlin-3是眾多MDM2抑制劑中的一類,Vassilev等[2]發(fā)現(xiàn),在野生型p53腫瘤細(xì)胞中,nutlin-3重建p53通路,誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)使用MDM2抑制劑nutlin-3作為誘導(dǎo)p53積累的藥理學(xué)工具,初步探討其對人A375細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

材料和方法

一、材料

永生化人黑素瘤細(xì)胞株A375細(xì)胞系產(chǎn)自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所,nutlin-3產(chǎn)自美國Sigma公司。二甲基亞砜(DMSO)產(chǎn)自生工生物工程(上海)股份有限公司,p53抗體(一抗)產(chǎn)自美國CST公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗產(chǎn)自生工生物工程(上海)股份有限公司,2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)試劑盒產(chǎn)自南京凱基生物有限公司,硝酸纖維素膜(NC膜)產(chǎn)自美國Millipore公司,噻唑藍(lán)(MTT)產(chǎn)自美國Sigma公司,碘化丙錠(PI)細(xì)胞周期檢測試劑盒(KGA512)和膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)凋亡檢測試劑盒產(chǎn)自南京凱基生物科技有限公司,細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)產(chǎn)自美國Sigma公司。12孔板Transwell小室產(chǎn)自美國Corning公司,倒置相差顯微鏡(CKX41-32PH)產(chǎn)自日本Olympus公司,ZS-3型酶聯(lián)免疫檢測儀產(chǎn)自北京市新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司,流式細(xì)胞儀產(chǎn)自美國Beckman公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng):A375細(xì)胞于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于含10%(v/v)胎牛血清的1640培養(yǎng)基中。傳代計數(shù)以105個/ml的密度均勻接種于培養(yǎng)皿和6孔板中繼續(xù)培養(yǎng),將生長良好處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.試劑配制:Nutlin-3用DMSO配制成2.5、5、10 μmol/L 濃度。

3.實(shí)驗(yàn)分組及處理:將A375細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對照組,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞接受不同濃度nutlin-3(2.5、5、10 μmol/L)處理,對照組細(xì)胞采用DMSO處理。

4.MTT法檢測nutlin-3對A375細(xì)胞增殖的影響:分組處理后A375細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 24、48、72 h 后,每孔加入 5 g/L MTT 10 μl,再孵育 4 h。 去上清,加入 DMSO 200 μl/孔,在 ZS-3酶標(biāo)儀上測定每孔吸光度(A)。腫瘤細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值)×100%。

5.Western印跡檢測p53蛋白的表達(dá):不同濃度 nutlin-3(2.5、5、10 μmol/L)作用 A375 細(xì)胞 24、48、72 h后,分別用0.25%胰蛋白酶消化,14 000×g4℃離心5 min,PBS洗3次,加入適當(dāng)體積的細(xì)胞裂解液。樣品在10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳,結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上,用含5%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液(PBS)封閉1 h,加入一抗(p53抗體),4℃過夜,PBS洗3次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫1 h,X線膠片顯影,掃描,Image J軟件分析圖片條帶,得出蛋白條帶峰面積值。

6.碘化丙錠(PI)染色流式細(xì)胞儀檢測A375細(xì)胞周期分布:分別于藥物作用24、48、72 h后,吸出上清培養(yǎng)液,胰酶消化,收集細(xì)胞,1 000 r/min(離心半徑12 cm)離心5 min,PBS洗2次,70%冰乙醇過夜。離心,棄上清,PBS洗2次,移至流式管中,加入100 μl RNaseA 37 ℃水浴 30 min;再加入 400 μl PI染色混勻,4℃避光30 min,流式細(xì)胞儀上樣,在488 nm激發(fā)波長下測定細(xì)胞DNA的含量,并用Multicyde分析軟件進(jìn)行分析,得出處于G0/G1、S和G2/M各期的細(xì)胞比例。

7.Annexin V-FITC染色流式細(xì)胞儀檢測A375細(xì)胞凋亡:分別于藥物作用24、48、72 h后,吸出上清培養(yǎng)液,胰酶消化,收集細(xì)胞,制備成單細(xì)胞懸液,重懸于500 μl結(jié)合緩沖液,加入5μl Annexin VFITC,混勻后,加入5 μl PI,室溫避光反應(yīng)5～15 min,上機(jī)檢測。

8.Transwell法檢測A375細(xì)胞的侵襲遷移:調(diào)節(jié)A375細(xì)胞密度為4×105個/ml,用含1%牛血清白蛋白(BSA)的無血清RPMI 1640重懸細(xì)胞,加入Transwell上室中,實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度nutlin-3(2.5、5、10 μmol/L),對照組加入相同體積 DMSO,Transwell下室加入含10%小牛血清的RPMI 1640,分別培養(yǎng)24、48、72 h后加 2%多聚甲醛固定細(xì)胞5 min,結(jié)晶紫溶液染色20 min,用PBS洗Transwell小室3次,倒置相差顯微鏡(400倍)下觀察和拍照,加入脫色液,于ZS-3型板式酶標(biāo)儀570 nm波長處檢測A值。遷移抑制率 =(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值)×100%。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS11.0軟件處理數(shù)據(jù),進(jìn)行重復(fù)測量的方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Nutlin-3對A375細(xì)胞增殖的影響

不同濃度 nutlin-3(2.5、5、10 μmol/L)能夠抑制A375細(xì)胞的增殖,如圖1所示,2.5、5、10 μmol/L nutlin-3 作用 24 h后,增殖抑制率(n=3)分別為(7.106±2.709)%、(13.417 ± 2.383)% 、(18.078 ±3.062)%;48 h的抑制率分別為(23.560±1.554)%、(39.786 ± 7.076)%、(53.548 ±3.600)%;72 h的抑制率分別為(21.971±6.586)%、(48.317 ± 10.421)%、(71.856 ±2.188)%。不同時間點(diǎn)之間的增殖抑制率差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=67.43,P＜0.01),48 h時抑制率最大,與24 h抑制率差別有統(tǒng)計學(xué)意義,而與72 h的抑制率差別無統(tǒng)計學(xué)意義;不同濃度間的抑制率差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=135.58,P＜0.01),濃度越高抑制率越高;時間和濃度之間有交互作用(F=26.95,P＜0.01)。

二、Nutlin-3對A375細(xì)胞p53蛋白表達(dá)的影響

不同濃度 nutlin-3(2.5、5、10 μmol/L)處理 A375細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)p53被激活,表達(dá)增多。如表1所示,不同時間點(diǎn)p53表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1255.00,P＜0.01),不同時間表達(dá)不同;不同濃度間的p53表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9196,P＜0.01),濃度越高,p53表達(dá)越高。時間與濃度之間交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義(F=826.79,P＜0.01)。見圖2。

三、Nutlin-3對A375細(xì)胞周期分布的影響

圖1 Nutlin-3對A375細(xì)胞增殖的抑制率

Nutlin-3作用于 A375 細(xì)胞 24、48、72 h 后,與對照組比較,不同濃度 nutlin-3(2.5、5、10 μmol/L)對A375細(xì)胞的細(xì)胞周期具有阻滯作用。如表1所示,不同時間點(diǎn)A375細(xì)胞G2期分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=831.38,P＜0.01),時間越長G2期細(xì)胞比例越高。不同濃度間A375細(xì)胞G2期分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=267.99,P＜0.01),濃度越高A375細(xì)胞G2期比例越高。時間與濃度之間交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義(F=21.60,P＜0.01)。圖3為nutlin-3作用48 h后人A375黑素瘤細(xì)胞周期G2期的分布。

表1 Nutlin-3對A375細(xì)胞p53表達(dá)、G2期比例及A375細(xì)胞凋亡的影響(±s)

表1 Nutlin-3對A375細(xì)胞p53表達(dá)、G2期比例及A375細(xì)胞凋亡的影響(±s)

注:n=3。 a:用二甲基亞砜處理A375細(xì)胞

組別 p53 G2期(%) 凋亡(%)對照組a 24 h 1 979.000±111.517 9.310±7.550 2.267±0.153 48 h 3 058.333±52.786 15.667±0.586 4.967±0.153 72 h 4 321.333±72.748 20.167±0.874 8.833±0.208 2.5 μmol/L nutlin-3 24 h 5 685.333±193.480 11.800±0.624 5.000±3.000 48 h 8 053.000±131.936 22.133±0.503 8.233±0.153 72 h 4 729.667±42.147 26.333±0.737 14.567±0.551 5 μmol/L nutlin-3 24 h 8 178.667±441.151 15.367±1.137 7.867±0.252 48 h 13 285.000±132.510 27.633±3.444 12.367±0.306 72 h 11 656.670±188.235 36.567±0.611 19.300±0.529 10 μmol/L nutlin-3 24 h 19 381.000±307.161 22.767±0.569 10.067±0.208 48 h 19 470.330±179.350 38.400±0.700 18.267±0.289 72 h 27 183.000±133.974 40.767±0.513 29.567±2.203

四、Nutlin-3對A375細(xì)胞凋亡的影響

圖2 Nutlin-3對人A375黑素瘤細(xì)胞p53蛋白表達(dá)的影響1:DMSO;2:2.5 μmol/L;3:5 μmol/L;4:10 μmol/L

圖3 Nutlin-3作用48 h,人A375黑素瘤細(xì)胞G2期的分布

Nutlin-3作用于 A375細(xì)胞 24、48、72 h后,與對照組比較,不同濃度 nutlin-3(2.5、5、10 μmol/L)增加A375細(xì)胞的凋亡比率。如表1所示,不同時間點(diǎn)A375細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=809.45,P＜0.01),時間越長A375細(xì)胞凋亡率越高;不同濃度間的A375細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=723.83,P＜0.01),濃度越高A375細(xì)胞凋亡率越高。時間與濃度之間交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義(F=44.48,P＜0.01)。圖4為nutlin-3作用72 h后人A375黑素瘤細(xì)胞凋亡比率。

圖4 Nutlin-3作用72 h,人A375黑素瘤細(xì)胞凋亡比率

五、Nutlin-3對A375細(xì)胞遷移的影響

如圖 5 所示,2.5、5、10 μmol/L nutlin-3 作用 24 h后,遷移抑制率(n=3)分別為(10.501±2.902)%、(11.422±7.893)%、(22.557±1.497)%;48 h的抑制率分別為(20.940±2.613)%、(36.177±5.062)%、(42.704±1.453)%;72 h的抑制率分別為(36.457± 2.600)%、(38.886± 6.116)%、(48.434±0.655)%。不同時間點(diǎn)之間A375遷移抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1 100.00,P＜0.01),時間越長遷移抑制率越高;不同濃度間遷移抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1 667.00,P＜0.01),濃度越高遷移抑制率越高。時間與濃度之間交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義(F=313.09,P＜0.01)。Nutlin-3能夠顯著地抑制A375細(xì)胞的遷移。

討 論

圖5 Nutlin-3對A375細(xì)胞遷移的抑制率

抑癌基因p53在黑素瘤的發(fā)生中起到了重要的作用,在黑素瘤早期p53極少發(fā)生突變,隨著其進(jìn)展,該基因突變率越來越高[3]。在黑素瘤中p53表達(dá)處于低水平,這是因?yàn)殡p微體基因編碼的產(chǎn)物與p53蛋白結(jié)合,MDM2是p53基因誘導(dǎo)產(chǎn)生的,并形成了自動負(fù)調(diào)節(jié)循環(huán),將p53轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核,并通過泛素化促進(jìn)p53的降解[4]。對p53和MDM2復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)的研究揭示,小分子抑制劑可以與MDM2競爭性結(jié)合p53位點(diǎn),以此達(dá)到升高p53的目的。

Nutlin-3是眾多MDM2抑制劑中的一類,能特異性與p53分子中3個疏水性氨基酸Leu26、Trp23、Phe19結(jié)合,而該位點(diǎn)就是與 MDM2的Try100相互作用的直接接觸點(diǎn),具有高效的親和性、專一性以及細(xì)胞可滲透性。Nutlin-3與p53結(jié)合后,抑制MDM2與p53的結(jié)合,使p53積聚,從而引起一系列p53介導(dǎo)的抗腫瘤作用:細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡。近來,Vassilev等[2]發(fā)現(xiàn),在野生型p53的HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞、RKO結(jié)腸癌細(xì)胞和SJSA-1骨肉瘤細(xì)胞中,nutlin-3在體內(nèi)外均能抑制MDM2-p53結(jié)合,促進(jìn)p53通路重建,從而激活p21,使腫瘤的細(xì)胞周期停滯,激活bax基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤生長。在其他一些表達(dá)野生型p53的腫瘤細(xì)胞(如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤[5]、神經(jīng)纖維瘤[6]、橫紋肌細(xì)胞癌[7]等)中nutlin-3也表現(xiàn)出同樣的作用。Nutlin-3可以誘導(dǎo)瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯,但卻只引起腫瘤細(xì)胞的凋亡[8-9]。在與其他化療藥物聯(lián)合作用于肺癌細(xì)胞時,nutlin-3可以通過激活p53引起細(xì)胞周期停滯,從而減輕紫杉醇對正常細(xì)胞的毒性作用[10]。有研究[11]發(fā)現(xiàn),nutlin-3可以減少表達(dá)野生型p53人HT1080鼻咽癌細(xì)胞、人U2OS骨肉瘤細(xì)胞、人SAOS成骨肉瘤細(xì)胞和人A549肺癌細(xì)胞的肌動蛋白纖維和黏著斑的大小和數(shù)量,引起細(xì)胞骨架重構(gòu),抑制細(xì)胞的遷徙和侵襲能力。

本實(shí)驗(yàn)首先采用MTT法檢測不同濃度nutlin-3作用不同時間對A375細(xì)胞增殖抑制率,發(fā)現(xiàn)nutlin-3對A375細(xì)胞的增殖抑制作用具有濃度依賴性和時間依賴性。進(jìn)一步用PI染色流式細(xì)胞儀檢測nutlin-3對細(xì)胞周期分布的影響,結(jié)果顯示,nutlin-3通過p53的積累,使A375細(xì)胞G2期比例增多,引起細(xì)胞周期停滯。正常情況下對于不能修復(fù)的DNA損傷,p53將啟動激活一系列下游轉(zhuǎn)錄信號,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此,我們進(jìn)一步檢測nutlin-3對A375細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示,nutlin-3促進(jìn)A375細(xì)胞凋亡。構(gòu)建Transwell小室是為了進(jìn)一步驗(yàn)證nutlin-3對A375細(xì)胞侵襲性的影響,結(jié)果顯示,nutlin-3能抑制A375細(xì)胞的侵襲遷移。

基于上述實(shí)驗(yàn)研究,我們發(fā)現(xiàn),nutlin-3通過積累p53蛋白,引起A375細(xì)胞周期G2期停滯,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,從而抑制A375細(xì)胞的增殖,并抑制A375細(xì)胞的侵襲遷移能力。在A375細(xì)胞荷瘤鼠動物模型中nutlin-3是否具有相同的抗腫瘤效應(yīng)?Nutlin-3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑具體是哪條?Nutlin-3治療腫瘤會不會導(dǎo)致p53的突變或其他p53通路的缺損?除了p53通路,nutlin-3是否還有別的通路?Nutlin-3能否單一或聯(lián)合使用來治療p53變異的腫瘤?這些問題都有待于進(jìn)一步研究。

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2014-04-19)

(本文編輯:尚淑賢)

Effect of nutlin-3 on the biological behavior of A375 human melanoma cells and its mechanism

Ding Xiaojie，Wei Dapeng，Chen Juping*.*Department of Dermatology，Second Clinical Medical College of Yangzhou University，Yangzhou 225001，China

Chen Juping，Email:chenjuping@medmail.com.cn

ObjectiveTo estimate the effect of a cis-imidazoline derivative，nutlin-3，on the biological behavior of A375 human melanoma cells，and to investigate its mechanism.MethodsCultured A375 cells were divided into several test groups treated with nutlin-3 at different concentrations(2.5，5，10 μmol/L)for 24，48 and 72 hours，and a control group treated with dimethyl sulfoxide(DMSO)only.Then，methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay was performed to evaluate cellular proliferative activity，Western blot to measure the expression of p53 protein，flow cytometry to estimate cell cycle phase distribution and apoptosis rate，and Transwell assay to evaluate migratory activity，of A375 cells.Statistical analysis was carried out by repeated-measures analysis of variance(ANOVA).ResultsAfter treatment with nutlin-3 of 2.5，5 and 10 μmol/L for 24，48 and 72 hours，significant differences were observed among different time points at each concentration and among different concentrations at the same time point in proliferation inhibition rate(F=67.43，135.58，respectively，bothP＜ 0.01) ，p53 protein expression level(F=1255.00，9196.00，respectively，bothP＜ 0.01)，percentage of cells at G2 phase(F=831.38，267.99，respectively，bothP＜ 0.01)，apoptosis rate(F=809.45，723.83，respectively，bothP＜ 0.01)，migration inhibition rate(F=1100.00，1667.00，respectively，bothP＜ 0.01).The influence of nutlin-3 on cellular proliferative activity increased with the increase in its concentration，and that on percentage of cells at G2 phase，apoptosis rate and migratory activity increased with the increase in its concentration and treatment duration.There was a significant interaction between the treatment duration and concentration of nutlin-3 for p53 protein expression level in(F=826.79，P＜ 0.01)，percentage of cells at G2 phase in(F=21.602，P＜ 0.01)，apoptosis rate in(F=44.48，P＜ 0.01)，migratory activity of(F=313.09，P＜ 0.01)，and cellular proliferative activity of(F=26.95，P＜0.01)，A375 cells.ConclusionNutlin-3 may inhibit the proliferation and migration of，but promote cell cycle arrest and apoptosis in，A375 cells，through accumulation of p53 protein.

Nutlin-3;Melanoma，experimental;Cell cycle;Apoptosis;Cell movement

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.011

225001揚(yáng)州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院皮膚科[丁小杰(現(xiàn)在南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院、江蘇省第二中醫(yī)院皮膚科,210017)、陳菊萍];四川大學(xué)基礎(chǔ)與法醫(yī)學(xué)院免疫教研室(魏大鵬)

陳菊萍,Email:chenjuping@medmail.com.cn