楊子良 駱丹 錢齊宏 杜納 余秀琴 王淼淼 閔瑋

黃芪甲苷對HaCaT細(xì)胞的光保護(hù)效能及其機(jī)制

楊子良 駱丹 錢齊宏 杜納 余秀琴 王淼淼 閔瑋

目的觀察黃芪甲苷對于中波紫外線(UVB)損傷的人表皮細(xì)胞的保護(hù)作用,探討其相關(guān)機(jī)制。方法將培養(yǎng)的永生化人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)分為對照組、UVB組、黃芪甲苷組和UVB+黃芪甲苷組,其中UVB組和UVB+黃芪甲苷組細(xì)胞接受50 mJ/cm2UVB照射,加藥組加入不同濃度的黃芪甲苷(10、20、50、100、200 mg/L)進(jìn)行干預(yù),24 h后CCK8法檢測細(xì)胞活性。根據(jù)CCK8法檢測結(jié)果選擇最佳藥物濃度(20 mg/L)進(jìn)行后繼實驗。照光后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平,Western印跡法檢測HaCaT細(xì)胞中p53、p38、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)和高遷移率族蛋白A1(HMGA-1)的表達(dá)。結(jié)果與對照組相比,10 mg/L和20 mg/L黃芪甲苷組對HaCaT細(xì)胞的增殖活性無明顯影響(F=1.32,P＞0.05),50、100和200 mg/L黃芪甲苷對細(xì)胞增殖活性有一定抑制作用(F=20.20,P＜0.05);UVB組與對照組比較,HaCaT細(xì)胞增殖活性顯著下降(F=99.00,P＜0.01)。與UVB組相比,UVB+黃芪甲苷(10～200 mg/L)組HaCaT細(xì)胞增殖活性不同程度升高(F=19.08,P＜0.01),其中UVB+20 mg/L黃芪甲苷組升高程度最高。進(jìn)一步實驗表明,與UVB組相比,UVB+20 mg/L黃芪甲苷組ROS產(chǎn)生受到明顯抑制(t=21.12,P＜0.01)。Western印跡結(jié)果表明,與對照組比較,UVB組p53、p38、MMP-9和HMGA-1蛋白的表達(dá)升高(均P＜0.01),而UVB+20 mg/L黃芪甲苷組細(xì)胞內(nèi)p53、p38、MMP-9和HMGA-1蛋白的表達(dá)水平較UVB組顯著降低(P＜0.01)。結(jié)論黃芪甲苷可有效抑制UVB引起的表皮細(xì)胞光損傷。

黃芪;紫外線;角蛋白細(xì)胞;活性氧

中波紫外線(UVB)是引起皮膚急慢性損害乃至皮膚癌的最重要波段之一[1-2]。已證實黃芪甲苷具有多種生物學(xué)活性,包括清除氧自由基、抗衰老、抗炎、抗病毒、保護(hù)血腦屏障以及一定的抗癌活性[3-4]。目前發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷具有一定的抗紫外線損傷效果[5-6]。我們通過觀察黃芪甲苷對細(xì)胞氧化損傷和腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的影響,探討黃芪甲苷的光保護(hù)作用機(jī)制。

材料與方法

一、材料

SUV-100日光紫外線模擬器及UVB輻射度監(jiān)視器(上海希格瑪高技術(shù)有限公司),人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞來自中國典型培養(yǎng)物保藏中心,流式細(xì)胞儀(美國EPICS公司),黃芪甲苷(中國藥品生物制品檢定所,批號110781-200613,標(biāo)準(zhǔn)品,純度 ≥ 99%),二氯熒光黃二乙酸酯(DCFHDA)(美國Sigma-Aldrich公司),p53和高遷移率族蛋白A1(high mobility group protein A-1,HMGA-1)一抗(美國Santa Cruz公司),基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9),p38和β肌動蛋白一抗(美國Cell Signaling Technology公司),高糖DMEM培養(yǎng)基產(chǎn)自美國Gibco公司,胎牛血清產(chǎn)自杭州四季青生物工程材料有限公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)和紫外線照射:HaCaT細(xì)胞在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。80%融合時,以0.25%胰酶消化,用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整為1×106/ml,定量接種于培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。將細(xì)胞分為對照組、UVB組、黃芪甲苷組和UVB+黃芪甲苷組,其中UVB組和UVB+黃芪甲苷組細(xì)胞生長至亞融合狀態(tài)時用日光紫外線模擬器對置于磷酸鹽緩沖液(PBS)里的細(xì)胞進(jìn)行UVB照射。根據(jù)前期研究結(jié)果[7],選取照射劑量為50 mJ/cm2,對照組和黃芪甲苷組在照光時覆以鋁箔,余處理同照光組。加藥組在照光前24 h和照光后加入不同濃度的黃芪甲苷孵育培養(yǎng)。每個處理條件重復(fù)實驗3次。

2.CCK8檢測細(xì)胞增殖活性:將各組細(xì)胞懸液接種于96孔板上,黃芪甲苷質(zhì)量濃度為0、10、20、50、100、200 mg/L,照光后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,分別收集各組細(xì)胞,每孔加入10 μl CCK8溶液,細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3 h,于酶標(biāo)儀上測定450 nm處吸光度(A值)。細(xì)胞增殖抑制率=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%,根據(jù)檢測結(jié)果選擇光保護(hù)效果顯著且無明顯細(xì)胞毒性的最佳藥物濃度(20 mg/L)進(jìn)行后續(xù)實驗。

3.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平:將HaCaT細(xì)胞接種于3.5 cm培養(yǎng)皿中,分組同上,黃芪甲苷濃度為20 mg/L。照光后繼續(xù)培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞,DCFH-DA法檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧的變化。PBS洗3次,加入10 mmol/L DCFH-DA 37℃避光反應(yīng)30 min,PBS洗3次,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長為485 nm,發(fā)射波長為538 nm)。

4.Western 印 跡 測 定 p53、p38、MMP-9 和HMGA-1表達(dá):將HaCaT細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中,分組同上,黃芪甲苷濃度為20 mg/L。照光后繼續(xù)培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度,制備12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE),每膠槽加入50 μg樣本,電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,加一抗4℃搖床孵育雜交過夜。加入二抗孵育1 h,顯色并用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)采集和分析數(shù)據(jù)。

5.統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS 11.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,實驗結(jié)果以±s表示,各組間進(jìn)行t檢驗或單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、黃芪甲苷和UVB對HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響

CCK8 法檢測結(jié)果表明,10、20、50、100、200 mg/L黃芪甲苷處理后,HaCaT細(xì)胞的增殖抑制率分別為3.12% ±0.72%、3.23% ±0.63%、9.77% ±1.83%、19.45%±1.55%和30.72%±2.26%,與對照組相比,10 mg/L和20 mg/L黃芪甲苷對HaCaT細(xì)胞的增殖活性均無明顯影響(F=1.32,P＞0.05);而50～200 mg/L黃芪甲苷對細(xì)胞增殖活性有一定抑制作用(F=20.20,P＜0.05)。經(jīng)50 mJ/cm2UVB照射并繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,與對照組相比,UVB組HaCaT細(xì)胞增殖活性顯著下降,細(xì)胞增殖抑制率為59.82%±3.32%(F=99.00,P＜0.01);與UVB組相比,UVB+黃芪甲苷(10、20、50、100、200 mg/L)組 HaCaT 細(xì)胞增殖活性不同程度升高,細(xì)胞增殖抑制率分別為42.33% ±2.34%、28.67% ±1.55%、32.53% ±1.57%、42.41%±3.96%和43.88%±1.93%(F=19.08,P＜0.01),其中20 mg/L黃芪甲苷抑制UVB損傷能力最強(qiáng)。因此選取20 mg/L黃芪甲苷進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 黃芪甲苷和中波紫外線對HaCaT細(xì)胞中活性氧水平的影響 1a:對照組;1b:黃芪甲苷組;1c:中波紫外線組;1d:中波紫外線+黃芪甲苷組

二、黃芪甲苷對HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

與對照組細(xì)胞相比,單純20 mg/L黃芪甲苷處理后,細(xì)胞內(nèi)ROS水平由生理狀態(tài)下的0.53±0.06降低至0.37±0.03(t=7.39,P＜0.05)。UVB照射后,細(xì)胞內(nèi)ROS水平增高至0.76±0.04,與對照組相比,t=7.43,P＜0.05;20 mg/L黃芪甲苷干預(yù)處理后細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低至0.59±0.07,與UVB組細(xì)胞相比,t=21.12,P＜0.01。見圖1。

三、黃芪甲苷對HaCaT細(xì)胞內(nèi)p53、p38、MMP-9和HMGA-1蛋白表達(dá)的影響

圖2 黃芪甲苷對HaCaT細(xì)胞p53、p38、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)和高遷移率族蛋白A1(HMGA-1)表達(dá)的影響 1:對照組;2:中波紫外線組;3:黃芪甲苷組;4:中波紫外線+黃芪甲苷組

表1 黃芪甲苷對HaCaT細(xì)胞p53、p38、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)和高遷移率族蛋白A1(HMGA-1)表達(dá)的影響(±s)

表1 黃芪甲苷對HaCaT細(xì)胞p53、p38、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)和高遷移率族蛋白A1(HMGA-1)表達(dá)的影響(±s)

注:n=3。UVB:中波紫外線

分組 p53 p38 MMP-9 HMGA-1對照組 1.00 1.00 1.00 1.00黃芪甲苷組 1.35±0.02 1.13±0.06 0.77±0.03 0.84±0.10 UVB組 2.68±0.03 2.18±0.11 1.99±0.09 1.44±0.05 UVB+黃芪甲苷組 1.63±0.12 1.67±0.08 1.42±0.06 1.05±0.04 F值 192.16 168.34 163.68 157.32 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

與對照組比較,UVB照射可不同程度增加細(xì)胞中p53、p38、MMP-9和HMGA-1蛋白的表達(dá)水平,而在照光前后24 h加入20 mg/L黃芪甲苷干預(yù),上述蛋白的表達(dá)水平均顯著下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。 見圖2,表1。

討 論

UVB是造成皮膚損傷的重要環(huán)境因素之一,包括紅斑、曬黑、炎癥、免疫抑制、光老化、光致癌等。UVB可直接引起皮膚細(xì)胞DNA損傷,同時也可通過產(chǎn)生氧自由基及活性氧,引起DNA氧化性損傷,誘發(fā)基因突變和皮膚癌的發(fā)生。表皮角質(zhì)形成細(xì)胞是UVB能量作用的主要靶部位。我們在前期研究中證實,黃芪甲苷可明顯抑制長波紫外線(UVA)對人皮膚真皮成纖維細(xì)胞的損傷作用,包括抑制氧化損傷、增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化防御能力、影響MMP-1和金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)等基因的表達(dá)等[8-9]。本實驗以人角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT為實驗對象,觀察黃芪甲苷對UVB急性照射損傷的保護(hù)效果。

本實驗中,不同濃度黃芪甲苷處理對生理狀態(tài)細(xì)胞增殖活性有一定影響,其中10 mg/L和20 mg/L黃芪甲苷對HaCaT細(xì)胞的增殖活性無明顯影響,而50～200 mg/L黃芪甲苷對細(xì)胞增殖活性有一定抑制作用,且與藥物濃度成正比,表明高濃度狀態(tài)下黃芪甲苷可抑制細(xì)胞生長。而UVB照射后,不同濃度的黃芪甲苷均可減輕UVB對HaCaT細(xì)胞的損傷作用,其中20 mg/L黃芪甲苷的保護(hù)效果最好。上述結(jié)果表明,在適宜藥物濃度下黃芪甲苷可顯著減輕UVB對細(xì)胞的損傷作用。

UVB誘導(dǎo)的皮膚細(xì)胞氧化損傷是造成細(xì)胞DNA損傷、免疫抑制、炎癥浸潤乃至皮膚癌發(fā)生的重要因素[10-11]。雖然皮膚細(xì)胞本身具有較強(qiáng)的清除活性氧和氧自由基的能力,但是長期UVB照射將削弱細(xì)胞抗氧化損傷的防御能力,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。我們應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平以評價黃芪甲苷抗UVB氧化損傷的效能,結(jié)果表明,黃芪甲苷干預(yù)顯著降低了UVB照射后細(xì)胞內(nèi)ROS水平,表明黃芪甲苷具有較強(qiáng)的保護(hù)皮膚細(xì)胞免于UVB氧化損傷的能力。

已有研究證實,紫外線可通過DNA損傷信號,即ROS-p38-p53路徑參與DNA修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡等過程[12-13]。MMP-9是MMP家族的重要成員,能降解破壞細(xì)胞外基質(zhì),與皮膚老化的發(fā)生和腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14]。HMGA-1屬于HMG家族,研究表明,HMGA-1表達(dá)是誘導(dǎo)正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的重要因素[15]。本實驗結(jié)果顯示,單純黃芪甲苷處理可一定程度下調(diào)MMP-9和HMGA-1表達(dá),提示黃芪甲苷可能具有一定的抗癌活性;同時,UVB可顯著增加p53、p38、MMP-9和HMGA-1蛋白的表達(dá)水平,而黃芪甲苷干預(yù)處理則可明顯抑制這些基因的表達(dá),進(jìn)而減少DNA損傷信號導(dǎo)致的細(xì)胞老化、凋亡和惡性轉(zhuǎn)化過程。

綜上所述,黃芪甲苷對于UVB引起的皮膚細(xì)胞損傷具有較強(qiáng)的保護(hù)效果。

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2014-01-13)

(本文編輯:尚淑賢)

Protective effect of astragalosideⅣ against ultraviolet B-induced photodamage to human HaCaT keratinocytes and its mechanisms

Yang Ziliang*，Luo Dan，Qian Qihong，Du Na，Yu Xiuqin，Wang Miaomiao，Min Wei.*Department of Dermatology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou 215006，China

Min Wei，Email:minwei@suda.edu.cn

ObjectiveTo evaluate the protective effect of astragaloside Ⅳ against ultraviolet B(UVB)-induced photodamage to human HaCaT keratinocytes，and to investigate its mechanisms.MethodsCultured immortalized human HaCaT keratinocytes were divided into four groups:blank control group receiving untreated，UVB group irradiated with 50 mJ/cm2UVB，astragalosideⅣ group treated with astragalosideⅣ，UVB+astragalosideⅣgroup treated with astragalosideⅣfor 24 hours before and after 50 mJ/cm2of UVB radiation.The concentration of astragaloside Ⅳ ranged from 10 to 200 mg/L in cell proliferation assay，and according to the results of proliferation assay，20 mg/L was determined as the optimal concentration in the other assays.At 24 hours after UVB radiation，cell counting kit-8(CCK8)assay was performed to evaluate cellular proliferative activity，flow cytometry to determine intracellular reactive oxygen species(ROS)levels，and Western blot to measure the expression levels of p53，p38，matrix metalloproteinase-9(MMP-9)and high mobility group Al(HMGA-1)protein in HaCaT cells.ResultsCompared with the control group，astragaloside Ⅳ at 10 and 20 mg/L had no inhibitory effect(F=1.32，P＞ 0.05)，while astragalosideⅣ at 50，100 and 200 mg/L showed significantly inhibitory effect(F=20.20，P＜ 0.05)，on the proliferation of HaCaT cells.In addition，cellular proliferative activity in the UVB group was significantly lower than that in the control group(F=99.00，P＜ 0.01).Compared with the UVB group，cellular proliferative activity increased to different degrees in HaCaT cells treated with both UVB and astragalosideⅣof 10-200 mg/L(F=19.08，P＜ 0.01)，with the strongest increase observed in those treated with UVB and astragalosideⅣ of 20 mg/L.Further experiments revealed reduced intracellular ROS levels in the UVB+astragalosideⅣ(20 mg/L)group compared with the UVB group(t=21.12，P＜ 0.01).Western blot assay showed that the expression levels of p53，p38，MMP-9 and HMGA-1 protein were significantly higher in the UVB group than in the control group(allP＜0.01)，but significantly lower in the UVB+astragalosideⅣ(20 mg/L)group than in the UVB group(allP＜0.01).ConclusionAstragalosideⅣcan effectively protect keratinocytes from UVB-induced photodamage.

Astragalus membranaceus;Ultraviolet rays;Keratinocytes;Reactive oxygen species

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.007

江蘇省自然科學(xué)基金青年基金(BK2012170);江蘇省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技項目(LZ11095);蘇州市科教興衛(wèi)項目(KJXW2011003)

215006蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科(楊子良、錢齊宏、杜納、余秀琴、王淼淼、閔瑋);南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科(駱丹)

閔瑋,Email:minwei@suda.edu.cn