蘇英 郭淑蘭 于曉靜 李春陽(yáng) 孫青

·論著·

甘露糖結(jié)合凝集素在尋常性銀屑病皮損中的表達(dá)

蘇英 郭淑蘭 于曉靜 李春陽(yáng) 孫青

目的檢測(cè)甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)在尋常性銀屑病患者皮損中的表達(dá),初步探討皮膚中MBL蛋白與銀屑病發(fā)病的關(guān)系。方法采用免疫組化法和Western印跡檢測(cè)30例進(jìn)行期尋常性銀屑病患者皮損、非皮損區(qū)皮膚(皮損周?chē)庥^正常皮膚)及30例健康人對(duì)照皮膚中MBL的表達(dá)。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,組間資料比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果免疫組化檢測(cè)顯示,銀屑病皮損區(qū)MBL呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)(相對(duì)表達(dá)量為0.636 7±0.515 1),非皮損區(qū)及健康對(duì)照皮膚中MBL表達(dá)弱或幾乎無(wú)表達(dá)(分別為0.416 3±0.160 1和0.381 6±0.310 9),銀屑病皮損區(qū)較非皮損區(qū)和健康對(duì)照皮膚顯著升高(t值分別為2.24和2.32,均P＜0.05),非皮損區(qū)與健康對(duì)照皮膚MBL表達(dá)水平間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.51,P＞0.05)。Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示,銀屑病皮損區(qū)、非皮損區(qū)及健康對(duì)照皮膚中均有MBL蛋白表達(dá),相對(duì)表達(dá)量分別為0.273 1±0.129 4、0.186 3±0.193 1、0.149 2±0.268 7,銀屑病皮損區(qū)較非皮損區(qū)及健康對(duì)照皮膚顯著增高(t值分別為2.05和2.28,均P＜0.05),非皮損區(qū)與健康對(duì)照皮膚表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論銀屑病患者皮損區(qū)MBL蛋白高表達(dá),可能與銀屑病的發(fā)病存在一定關(guān)系。

銀屑病;甘露糖結(jié)合凝集素類(lèi);免疫,天然

天然免疫紊亂在銀屑病發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1-3]。甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)作為天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分,在機(jī)體天然免疫防御和免疫復(fù)合物清除中發(fā)揮作用。本研究擬通過(guò)免疫組化和蛋白印跡法觀察尋常性銀屑病患者皮損、非皮損和健康對(duì)照皮膚組織中MBL的表達(dá)情況,初步探討MBL與銀屑病發(fā)病可能存在的關(guān)系。

資料與方法

一、研究對(duì)象

進(jìn)行期尋常性銀屑病患者30例,男19例,女11例;年齡13～63歲,平均36.7歲,病程0.3～10年。取皮膚標(biāo)本前2周內(nèi)未外用糖皮質(zhì)激素,3個(gè)月內(nèi)未接受糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、生物制劑、激光治療及光化學(xué)療法。標(biāo)本取自銀屑病皮損和皮損周?chē)庥^正常皮膚。30例健康對(duì)照皮膚來(lái)自本院美容整形科手術(shù)患者,男18例,女12例;年齡16～61歲,平均年齡33.6歲。銀屑病患者組和健康對(duì)照組性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者均簽署知情同意書(shū)。

二、主要試劑

MBL單克隆抗體(丹麥Antibodyshop公司生產(chǎn)),抗β肌動(dòng)蛋白抗體(上海碧云天生物有限公司),凱基全蛋白提取試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司),免疫組化SABC試劑盒(北京康煜輝生物技術(shù)有限公司)。P0012S型(Bicinchoninic acid)蛋白濃度測(cè)定試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL試劑盒,美國(guó)Santa Cruz公司)。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.免疫組化檢測(cè):取銀屑病患者皮損、非皮損及健康對(duì)照皮膚進(jìn)行MBL免疫組化檢測(cè)。切片組織行熱抗原修復(fù);10%山羊血清(PBS稀釋)封閉,室溫孵育20 min;滴加一抗(MBL稀釋滴度1∶500)工作液,4℃過(guò)夜;滴加生物素標(biāo)記二抗,37℃孵育20 min;滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素,37℃孵育15 min;二氨基聯(lián)苯(DAB)顯色;后經(jīng)蘇木精復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。應(yīng)用ImagePro Plus6軟件測(cè)定免疫組化染色區(qū)域吸光度(A值)進(jìn)行半定量分析。

2.Western印跡分析:取-80℃保存的組織塊100 mg,采用凱基全蛋白提取試劑盒進(jìn)行蛋白抽提,BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗膜后加入一抗(1∶2 000 MBL抗體、1∶500 β肌動(dòng)蛋白抗體),4℃過(guò)夜,PBS洗膜。然后加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗鼠二抗(1∶1 250)反應(yīng)液,室溫下振蕩反應(yīng)。應(yīng)用ECL試劑盒顯影、定影,凝膠成像系統(tǒng)中成像。用TotalLab1.0軟件進(jìn)行各條帶相對(duì)吸光度值的半定量分析,以各目的條帶與β肌動(dòng)蛋白的積分吸光度值(IOD)的比值代表其蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、免疫組化檢測(cè)銀屑病患者皮損、非皮損及健康對(duì)照皮膚MBL的表達(dá)

銀屑病患者皮損、非皮損及健康對(duì)照皮膚均見(jiàn)MBL表達(dá),其相對(duì)表達(dá)量分別為0.636 7±0.515 1、0.416 3±0.160 1、0.381 6±0.310 9,銀屑病患者皮損部MBL表達(dá)水平較非皮損區(qū)和健康對(duì)照皮膚顯著升高(t值分別為2.24和2.32,均P＜0.05),非皮損區(qū)與健康對(duì)照皮膚MBL表達(dá)水平間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.51,P＞0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)在銀屑病皮損區(qū)及非皮損區(qū)的免疫組化染色(免疫組化×400) 1a:銀屑病非皮損區(qū)MBL表達(dá)在棘細(xì)胞層及基底層,表達(dá)較弱;1b:銀屑病皮損區(qū)MBL表達(dá)主要在基底層,表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性;1c:健康對(duì)照皮膚幾乎無(wú)陽(yáng)性表達(dá)

圖2 甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)蛋白在銀屑病皮損區(qū)及非皮損區(qū)皮膚中的表達(dá) 1:銀屑病非皮損;2:銀屑病皮損;3:健康對(duì)照皮膚

二、Western印跡檢測(cè)銀屑病患者皮損、非皮損及健康對(duì)照皮膚MBL的表達(dá)

銀屑病患者皮損、非皮損及健康對(duì)照皮膚均有MBL表達(dá),其MBL蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.273 1±0.129 4、0.186 3 ± 0.193 1、0.149 2± 0.268 7, 銀屑病患者皮損部位MBL表達(dá)水平較非皮損區(qū)及健康對(duì)照皮膚顯著升高(t值分別為2.05和2.28,均P＜0.05)。非皮損區(qū)與健康對(duì)照皮膚MBL表達(dá)水平間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.61,P＞0.05)。見(jiàn)圖2。

討 論

銀屑病患者體內(nèi)存在天然免疫紊亂現(xiàn)象,選擇天然免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞和分子成分作為靶點(diǎn)已成為治療銀屑病的重要手段和研究方向[4-5]。針對(duì)部分天然免疫相關(guān)因子白細(xì)胞介素12/23、腫瘤壞死因子α治療銀屑病已進(jìn)入Ⅱ期臨床研究及臨床應(yīng)用階段,并取得令人滿(mǎn)意的治療效果[4-6],提示天然免疫在銀屑病的發(fā)病過(guò)程中可能起著非常關(guān)鍵的作用。

人類(lèi)甘露糖結(jié)合凝集素是天然免疫防御系統(tǒng)中的重要組成部分,為非酶非抗體的天然一線(xiàn)抗感染免疫分子,是一種鈣離子依賴(lài)性糖結(jié)合蛋白,在肝臟合成后分泌到血液中。在抗原抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)之前，誘導(dǎo)激活機(jī)體的非特異性免疫反應(yīng),現(xiàn)已證實(shí)MBL至少有以下4種功能:激活補(bǔ)體、促進(jìn)調(diào)理吞噬、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及促進(jìn)凋亡[7-8]。如果MBL發(fā)生基因突變,導(dǎo)致缺損或異常,則影響機(jī)體的天然免疫能力。多項(xiàng)研究表明,MBL基因突變和由此引起的MBL血清水平的變化與感染性疾病、自身免疫性疾病的發(fā)生有顯著相關(guān)關(guān)系[9-12]。有學(xué)者研究MBL與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)系,結(jié)果顯示,MBL2基因多態(tài)性和低MBL血清水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生及臨床癥狀的嚴(yán)重程度顯著相關(guān)[12-13]。Tao等[10]對(duì)151例呼吸道感染患兒MBL結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子區(qū)的基因多態(tài)性、血清MBL水平與感染的關(guān)系進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)患兒血清MBL濃度明顯低于健康組,其等位基因變異頻率顯著高于健康組,且基因變異與血清MBL濃度間存在一定相關(guān)關(guān)系。2003年Jensenius等[14]首次合成了重組MBL,為開(kāi)展藥物臨床實(shí)驗(yàn)提供了條件。重組MBL對(duì)于感染性疾病、乳腺癌等患者的Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)已取得較為滿(mǎn)意的臨床療效[15-17]。

我們的前期研究結(jié)果顯示,銀屑病組MBL突變基因型頻率顯著高于健康對(duì)照組,銀屑病組GAC等位基因頻率增高,而銀屑病患者血清MBL水平顯著低于對(duì)照組[18]。本文進(jìn)一步對(duì)銀屑病患者皮損中MBL表達(dá)的情況進(jìn)行免疫組化及Western印跡檢測(cè),結(jié)果表明,銀屑病皮損區(qū)MBL水平較非皮損區(qū)及健康對(duì)照皮膚顯著增高。因而推測(cè)銀屑病患者血清MBL水平降低除受MBL基因多態(tài)性的影響外,還可能與皮損區(qū)MBL沉積等代謝消耗有關(guān),亦或可能有其他機(jī)制存在。我們推測(cè),銀屑病皮損區(qū)的MBL可能通過(guò)激活補(bǔ)體等方式,介導(dǎo)炎癥介質(zhì)對(duì)局部皮膚造成損傷。

Turan等[19]對(duì)50例銀屑病患者M(jìn)BL基因第54號(hào)密碼子基因多態(tài)性進(jìn)行研究,結(jié)果顯示,銀屑病患者M(jìn)BL突變基因型GGC/GAC頻率顯著高于健康對(duì)照組,但對(duì)銀屑病皮損中MBL的表達(dá)未做探討。MBL與銀屑病發(fā)病的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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2014-03-19)

(本文編輯:顏艷)

Expression of mannose-binding lectin in lesions of psoriasis vulgaris

Su Ying，Guo Shulan，Yu Xiaojing，Li Chunyang，Sun Qing.Department of Dermatology，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，China

Sun Qing，Email:sywxlwjz@163.com

ObjectiveTo investigate the expression of mannose-binding lectin(MBL)in lesions of patients with psoriasis vulgaris，and to explore the relationship between MBL and psoriasis pathogenesis.MethodsImmunohistochemistry and Western blot were performed to detect the expression of MBL in lesional and normalappearing perilesional skin of 30 patients with progressive psoriasis vulgaris，as well as in normal skin of 30 healthy human controls.Statistical analysis was carried out byttest using SPSS13.0 software.ResultsImmunohistochemistry showed that MBL was expressed in lesional psoriatic skin，but weakly expressed or absent in normalappearing perilesional skin and normal control skin，with the relative expression level of MBL in lesional skin significantly higher than that in perilesional skin and normal control skin(0.636 7±0.515 1 vs.0.416 3±0.160 1 and 0.381 6 ± 0.310 9，t=2.24，2.32，respectively，bothP＜ 0.05).Western blot revealed a positive expression of MBL protein in all the skin specimens，and the expression intensity of MBL protein in lesional psoriatic skin was significantly increased compared with perilesional psoriatic skin and normal control skin(0.273 1±0.129 4 vs.0.186 3 ± 0.193 1 and 0.149 2 ± 0.268 7，t=2.05，2.28，respectively，bothP＜ 0.05).No significant difference was shown in the expression of MBL protein between perilesional psoriatic skin and normal control skin by immunohistochemistry(t=1.51，P＞ 0.05)or Western blot(t=0.61，P＞ 0.05).ConclusionThere is a high expression of MBL protein in lesions of patients with psoriasis vulgaris，which may be somewhat associated with the pathogenesis of psoriasis.

Psoriasis;Mannose-binding lectins;Immunity，natural

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.001

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(30901295);山東省自然科學(xué)基金(Y2007C033)

250012濟(jì)南，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院皮膚科

孫青,Email:sywxlwjz@163.com