李延輝+++++葉仕英+++++何小杰+++++徐飛+++++袁煜宗

[摘要] 目的 探討不同年齡白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞（LECs）中caspase-3、Fas/FasL的表達(dá)及臨床意義。 方法 選擇2007年9月～2012年2月本院眼科收治的白內(nèi)障患者50例為研究對象，其中25～49歲設(shè)為白內(nèi)障中青年組，≥50歲設(shè)為白內(nèi)障老年組，各25例，并收集20例成人尸體解剖非白內(nèi)障眼球?yàn)閷φ战M，其中25～49歲設(shè)為中青年對照組，≥50歲設(shè)為老年對照組，各10例。采用免疫組織化學(xué)法檢測各組晶狀體前囊膜組織中caspase-3、Fas、FasL的表達(dá)。 結(jié)果 白內(nèi)障老年組、白內(nèi)障中青年組、老年對照組和中青年對照組LECs中凋亡細(xì)胞百分率分別為34.0%、16.0%、2.0%、3.0%，白內(nèi)障老年組顯著高于白內(nèi)障中青年和老年對照組，白內(nèi)障中青年組顯著高于中青年對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。白內(nèi)障老年組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的陽性表達(dá)率分別為84.0%、60.0%、68.0%，白內(nèi)障中青年組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的陽性表達(dá)率分別為44.0%、24.0%、32.0%，老年對照組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的陽性表達(dá)率分別為10.0%、10.0%、20.0%，中青年對照組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的陽性表達(dá)率分別為10.0%、0.0%、0.0%，4組caspase-3、Fas、FasL蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。老年白內(nèi)障患者和中青年白內(nèi)障患者中，LECs凋亡與caspase-3和Fas、FasL表達(dá)水平均呈正相關(guān)（r=0.621、0.583、0.621，P<0.01）。 結(jié)論 老年性白內(nèi)障形成過程可能與LECs的凋亡及caspase-3、Fas/FasL的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 白內(nèi)障；caspase-3；Fas；FasL；晶狀體上皮細(xì)胞

[中圖分類號] R776.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）11（a）-0015-03

白內(nèi)障是目前世界上第一位致盲眼病，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前臨床上尚無切實(shí)有效的預(yù)防藥物。因此，通過各種先進(jìn)研究技術(shù)的綜合應(yīng)用深入白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制，抓住凋亡相關(guān)基因在白內(nèi)障發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制從而研發(fā)相關(guān)分子作用靶點(diǎn)，已成為一項(xiàng)十分有益于防治白內(nèi)障的課題[1-2]。caspase是一組半胱氨酸蛋白酶家族，近年來相關(guān)資料顯示，caspase-3可能參與了白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞（lens epithelial cells，LECs）的凋亡和白內(nèi)障的形成[3-4]。目前對Fas/FasL系統(tǒng)的凋亡機(jī)制研究多數(shù)集中于其在腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用及意義[5-6]，而對該系統(tǒng)在白內(nèi)障發(fā)生過程中的作用機(jī)制尚不明確[7]。本研究通過免疫組織化學(xué)法對不同年齡白內(nèi)障患者及正常人的晶狀體上皮中caspase-3、Fas/FasL的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，旨在初步探討caspase-3、Fas/FasL在不同年齡白內(nèi)障發(fā)生過程中所具有的分子生物學(xué)功能，為預(yù)防白內(nèi)障發(fā)生及開發(fā)更有效的藥物治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2007年9月～2012年2月本院眼科收治的白內(nèi)障患者50例為研究對象，其中25～49歲設(shè)為白內(nèi)障中青年組，≥50歲設(shè)為白內(nèi)障老年組，各25例。其中白內(nèi)障中青年組，男14例（14眼），女11例（11眼），年齡25～47歲，平均（35.6±1.6）歲；白內(nèi)障老年組，男13例（13眼），女12例（12眼），年齡50～79歲，平均（62.4±2.6）歲。兩組患者均在常規(guī)白內(nèi)障顯微手術(shù)過程中采用連續(xù)環(huán)形撕囊，晶狀體前囊膜的直徑約為5 mm。另選擇暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科進(jìn)行成人尸體解剖的眼球晶狀體前囊膜標(biāo)本20例，均證實(shí)無白內(nèi)障發(fā)生，其中25～49歲設(shè)為中青年對照組，≥50歲設(shè)為老年對照組，各10例。4組晶狀體前囊膜標(biāo)本均經(jīng)10%中性緩沖甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。

1.2 方法

1.2.1 TUNEL方法檢測細(xì)胞凋亡 采用TUNEL法檢測4組晶狀體前囊膜標(biāo)本中的細(xì)胞凋亡情況。TUNEL法試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，操作方法及過程嚴(yán)格按照試劑盒要求步驟進(jìn)行。檢測結(jié)果判定：光鏡下觀察，LECs細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒者為凋亡細(xì)胞，而染為藍(lán)色的細(xì)胞核為正常LECs細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率：細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測 采用免疫組織化學(xué)EnVision法檢測各組LECs中caspase-3、Fas/FasL的表達(dá)。操作方法及過程嚴(yán)格按照EnVision法試劑盒要求步驟進(jìn)行。染色結(jié)果判斷[6]：LECs胞質(zhì)或胞膜內(nèi)見黃色或棕色顆粒為染色陽性。每張切片隨機(jī)選擇檢查5個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞率。0～5%為（-）；6%～19%為（+）；20%～35%為（++）；36%～50%為（+++）。（+）～（+++）記為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，各指標(biāo)之間的關(guān)系分析采用等級相關(guān)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組LECs凋亡情況的比較

白內(nèi)障老年組、白內(nèi)障中青年組、老年對照組和中青年對照組LECs中凋亡細(xì)胞百分率分別為34.0%、16.0%、2.0%、3.0%，4組凋亡細(xì)胞百分率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.82，P<0.01）。白內(nèi)障老年組顯著高于白內(nèi)障中青年組和老年對照組（χ2=9.27、11.59，P<0.01），白內(nèi)障中青年組顯著高于中青年對照組（χ2=7.59，P<0.01）。

2.2 4組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白陽性表達(dá)的比較

白內(nèi)障老年組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的陽性表達(dá)率分別為84.0%（21/25）、60.0%（15/25）、68.0%（17/25），白內(nèi)障中青年組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的陽性表達(dá)率分別為44.0%（11/25）、24.0%（6/25）、32.0%（8/25），老年對照組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的陽性表達(dá)率為10.0%（1/10）、10.0%（1/10）、20.0%（2/10），中青年對照組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的陽性表達(dá)率為10.0%（1/10）、0.0%、0.0%，4組caspase-3、Fas、FasL蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.19、8.43、9.11，P<0.01）。

2.3 LECs凋亡與caspase-3和Fas、FasL表達(dá)之間的關(guān)系

25例老年白內(nèi)障患者和25例中青年白內(nèi)障患者中，LECs凋亡與caspase-3和Fas、FasL表達(dá)水平均呈正相關(guān)（r=0.621、0.583、0.621，P<0.01）。

3 討論

近年來研究表明，LECs的損害是白內(nèi)障發(fā)生過程中的早期事件，除先天性白內(nèi)障以外，其他類型的白內(nèi)障形成均與LECs發(fā)生凋亡密切相關(guān)。推測LECs發(fā)生凋亡后，致使LECs的密度降低，LECs下面的晶狀體纖維滲透壓失去平衡，最終部分晶狀體纖維的透明性和完整性受到不良影響[8-9]。本研究結(jié)果顯示，白內(nèi)障老年組、白內(nèi)障中青年組、老年對照組和中青年對照組LECs中凋亡細(xì)胞百分率分別為34.0%、16.0%、2.0%、3.0%，白內(nèi)障老年組顯著高于白內(nèi)障中青年和老年對照組，白內(nèi)障中青年組顯著高于中青年對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示在白內(nèi)障的發(fā)生過程中，LECs發(fā)生凋亡可能是其細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，尤其在老年性白內(nèi)障的發(fā)生過程中可能起重要的作用。

caspase-3是近年來發(fā)現(xiàn)的致使哺乳動物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶[10-11]，在亞硒酸鹽誘導(dǎo)的大鼠晶狀體上皮細(xì)胞凋亡過程中，caspase-3酶活性增高并起關(guān)鍵作用，提示caspase-3可能參與了晶狀體上皮細(xì)胞凋亡和白內(nèi)障的形成。國內(nèi)一些研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，caspase-3在白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。研究認(rèn)為促凋亡基因Fas與FasL的相互作用及其構(gòu)成的復(fù)雜體系，是多種細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制之一。Fas屬于腫瘤壞死因子（TNF）家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白，而FasL屬于TNF家族的Ⅱ型膜蛋白，兩者結(jié)合在凋亡過程中具有誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用[12]。目前對Fas/FasL系統(tǒng)的凋亡機(jī)制研究多數(shù)集中于其在腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用及意義，而對該系統(tǒng)在白內(nèi)障發(fā)生過程中的作用機(jī)制尚不明確。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測不同年齡白內(nèi)障患者及正常人的晶狀體上皮中凋亡相關(guān)基因caspase-3、Fas/FasL的表達(dá)情況，結(jié)果表明4組caspase-3、Fas、FasL蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），老年性白內(nèi)障患者LECs中caspase-3、Fas、FasL的陽性表達(dá)率均明顯高于白內(nèi)障中青年患者和正常對照組，白內(nèi)障中青年患者LECs中caspase-3、Fas、FasL的陽性表達(dá)率均明顯高于正常對照組；同時(shí)對LECs凋亡與caspase-3和Fas、FasL表達(dá)之間的關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)老年性白內(nèi)障患者和中青年白內(nèi)障患者中，LECs凋亡與caspase-3和Fas、FasL表達(dá)水平均呈正相關(guān)（r=0.621、0.583、0.621，P<0.01），提示caspase-3、Fas/FasL可能參與了白內(nèi)障形成過程，且在老年性白內(nèi)障形成過程中具有更重要的作用。推測LECs受到外界各種不同刺激后，caspase-3蛋白酶系統(tǒng)首先被激活，晶狀體內(nèi)外鈣離子流動失去正常時(shí)的平穩(wěn)狀況，細(xì)胞骨架及晶體連接蛋白逐漸被降解；同時(shí)也激活了FasL-Fas系統(tǒng)，大量FasL-Fas表達(dá)并結(jié)合，從而提供誘導(dǎo)凋亡的傳導(dǎo)信號，晶狀體連接蛋白進(jìn)一步被降解，水電平衡失調(diào)以及LECs發(fā)生大量凋亡的病理改變，推動白內(nèi)障的形成進(jìn)程[13-15]。

綜上所述，老年性白內(nèi)障形成過程可能與LECs的凋亡及caspase-3、Fas/FasL的表達(dá)調(diào)控有關(guān)，相信隨著對白內(nèi)障形成機(jī)制的不斷深入了解及凋亡機(jī)制的逐漸明確，調(diào)節(jié)caspase-3、Fas/FasL表達(dá)的相關(guān)分子靶點(diǎn)藥物的進(jìn)一步開發(fā)及應(yīng)用，都將為預(yù)防白內(nèi)障及其非手術(shù)治療方案的研發(fā)提供新的指導(dǎo)方向。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 陳爽，趙清來.熱休克蛋白27、70在老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2013，7（13）：10-11.

[2] 喬淑琴，李軍，李辰.年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體囊膜中P33INGl的表達(dá)[J].中國社區(qū)醫(yī)師：醫(yī)學(xué)專業(yè)，2013（6）：96-97.

[3] 郭海，才秀蓮.Caspase家族與細(xì)胞凋亡及誘發(fā)因素研究進(jìn)展[J].河南職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，24（6）：847-850.

[4] 馬瀏莉，劉世龍，陳彥群.晶狀體上皮細(xì)胞（LECs）凋亡及凋亡相關(guān)基因caspase-3表達(dá)與老年性白內(nèi)障[J].青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，33（3）：179-181.

[5] 郭曉東，李志偉，楊美，等.肝癌組織中凋亡調(diào)控因子Fas、FasL及caspase-3的表達(dá)及意義[J].肝臟，2014（4）：250-253.

[6] 王麗敏，田玉鳳，譚振香，等.腎茶對UUO大鼠腎組織FaS、FasL表達(dá)的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2014，37（3）：36-38.

[7] 尹莉莉，管懷進(jìn)，胡紅莉，等.白內(nèi)障手術(shù)摘出前囊下晶狀體上皮細(xì)胞中整聯(lián)蛋白、Fas蛋白的表達(dá)[J].眼外傷職業(yè)眼病雜志，2008，30（12）：918-920.

[8] Huang XR，Qi MX，Wang ZY，et al.Inhibition effects of compound leech eye drops on apoptosis of lens epithelial cells and expressions of Bcl-2 and Bax genesin rats[J].Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao，2007，5（6）：681-685.

[9] 何潔兒，劉良平，詹姣，等.抑制泛素-蛋白酶體途徑對晶狀體上皮細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用[J].廣東醫(yī)學(xué)，2014，35（1）：56-58.

[10] 肖愛嬌，康明非，張毫，等.艾灸預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷模型大鼠大腦皮質(zhì)caspase-3蛋白表達(dá)的影響[J].天津醫(yī)藥，2014，42（6）：544-546.

[11] 段翠翠，王慶國，王為光，等.急性白血病病人XIAP和Caspase-3的表達(dá)及其臨床意義[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2014，37（2）：83-84.

[12] 粱曉陽，劉洛同，明揚(yáng)，等.人腦膠質(zhì)瘤中Fas、Caspase-8的表達(dá)[J].海南醫(yī)學(xué)，2014，25（7）：947-949.

[13] 陳雪芳，劉忠鑫，陳炳榮，等.白藜蘆醇對過氧化氫誘導(dǎo)鼠晶狀體上皮細(xì)胞凋亡保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，47（3）：229-231.

[14] 于永斌，王林，關(guān)立南.地塞米松和RU-486作用人晶狀體上皮細(xì)胞后糖皮質(zhì)激素受體和Caspase-3的表達(dá)變化[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，47（6）：511-516.

[15] 鄭廣瑛，梁圓圓，王倩.年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞的Smac、caspase-3表達(dá)及死亡方式[J].眼科研究，2010，28（4）：351-355.

（收稿日期：2014-09-30 本文編輯：郭靜娟）