張于++李云++裴斐++++周洪霞++++徐勝++董偉

[摘要] 目的 觀察腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡變化及黃體酮的保護(hù)作用。 方法 雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦損傷組和黃體酮治療組，大鼠腦損傷模型制作是利用改良的Feeney自由落體損傷裝置。各組于傷后24、48、72 h取材。用免疫組織化學(xué)法觀察大鼠皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的表達(dá)水平變化。 結(jié)果 腦損傷組的Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)較假手術(shù)組顯著增加，黃體酮治療組與腦損傷組比較，Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 黃體酮抑制腦損傷后Caspase-3的表達(dá)可能是黃體酮腦保護(hù)作用機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 黃體酮；腦損傷；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3

[中圖分類號(hào)] 651.1+5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）11（a）-0012-03

腦損傷是嚴(yán)重危害人類健康和威脅生命的疾病之一。腦損傷后的繼發(fā)性損傷以往認(rèn)為主要是神經(jīng)細(xì)胞水腫和壞死，近年發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷性腦損傷后存在10%～50%的細(xì)胞凋亡，而且主要存在于皮質(zhì)和海馬等部位。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）處于細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵地位，是細(xì)胞凋亡過(guò)程的最終執(zhí)行者[1]，在腦損傷后各種病理因素作用下，Caspase-3被激活，通過(guò)作用于底物引起細(xì)胞凋亡。對(duì)腦損傷后的繼發(fā)性損傷，目前尚無(wú)有效的治療藥物。近年研究發(fā)現(xiàn)，黃體酮（progesterone，PROG）作為一種神經(jīng)甾體激素，在體內(nèi)、體外等多種實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)具有腦損傷保護(hù)作用[2]，但PROG對(duì)腦損傷后細(xì)胞凋亡的影響存在爭(zhēng)議。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立Feeney自由落體大鼠腦損傷模型，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)，探討PROG對(duì)大鼠腦損傷后Caspase-3表達(dá)的影響，以闡明PROG對(duì)腦損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

恒冷箱組織切片機(jī)，CM1900型，德國(guó)Leica公司；Olympus顯微攝影裝置，PM-10AD型，日本Olympus公司。PROG試劑，購(gòu)自Sigma公司；Caspase-3一抗試劑，購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

雄性成年SD大鼠54只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體重250～300 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組18只、腦損傷組18只、PROG治療組18只；每組又分為24、48、72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化。

1.3 動(dòng)物模型

采用改進(jìn)的Feeney自由落體方法建立大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型。麻醉采用10%水合氯醛腹腔麻醉，麻醉后切開(kāi)頭皮，打開(kāi)直徑5 mm的骨窗，其位置在矢狀縫后1.5 mm，中線旁2.5 mm處；自由落體重錘質(zhì)量40 g，從25 cm 處高度自由落下造成腦損傷。假手術(shù)組僅切開(kāi)頭皮，在相同位置開(kāi)同樣大小的骨窗。PROG試劑溶解于22.5% 2-羥丙基-β-環(huán)糊精溶質(zhì)中，PROG治療組傷后1、6 h腹腔注射PROG 16 mg/kg以利于快速吸收，接下來(lái)連續(xù)每天1次皮下注射。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

分別于傷后24、48、72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)大鼠腦組織進(jìn)行甲醛灌注，并且取材固定，自視交叉后做片厚5 μm的冠狀切片待用。Caspase-3免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用SP法，按照免疫組織化學(xué)法說(shuō)明書(shū)加入一抗和二抗等操作。切片在400倍光鏡下觀察，利用免疫組織化學(xué)CMIAS真彩色醫(yī)學(xué)圖像自動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5個(gè)視野的平均值代表各區(qū)計(jì)數(shù)結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析，以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

假手術(shù)組少見(jiàn)Caspase-3表達(dá)，腦損傷組傷灶周圍皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)，可見(jiàn)大量Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)；與假手術(shù)組比較，腦損傷組的Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；黃體酮治療組在損傷的周圍皮質(zhì)和傷側(cè)海馬CA1區(qū)Caspase-3表達(dá)與腦損傷組比較明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

3 討論

隨著社會(huì)的發(fā)展，腦損傷患者逐年增多。發(fā)達(dá)國(guó)家的顱腦損傷年發(fā)生率高達(dá)（150～250）/10萬(wàn)人；我國(guó)顱腦損傷的年發(fā)生率為（100～200）/10萬(wàn)人，直接和間接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百億元。腦損傷可以分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，原發(fā)性損傷無(wú)法恢復(fù)；而繼發(fā)性損傷通過(guò)鈣超載、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、自由基產(chǎn)生、炎癥反應(yīng)等多種因素加重腦損傷，進(jìn)而影響神經(jīng)功能[3-4]。其中細(xì)胞凋亡在繼發(fā)性腦損傷中扮演重要角色[5-6]，Caspase是細(xì)胞凋亡事件的執(zhí)行者，Caspase-3的激活通過(guò)作用于DNA修復(fù)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白等裂解，最終發(fā)生細(xì)胞凋亡。

PROG對(duì)腦損傷后細(xì)胞凋亡的影響存在爭(zhēng)議。Djebaili等[7]通過(guò)建立腦損傷模型，給予PROG干預(yù)，發(fā)現(xiàn)PROG可降低Caspase-3的活性。然而，Hoffman等[8]建立過(guò)敏性腦炎模型，利用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示PROG促進(jìn)凋亡的方式；進(jìn)一步有學(xué)者Garcia-Segura等[9]研究在雌激素條件下PROG對(duì)凋亡影響的實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示下丘腦弓狀神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增加，說(shuō)明PROG對(duì)雌激素抗凋亡具有抑制作用。上述文獻(xiàn)表明，PROG對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)凋亡的影響是非常復(fù)雜的，在不同的模型、不同的實(shí)驗(yàn)條件下作用效果都不一致。本實(shí)驗(yàn)利用自由落體腦損傷模型，研究了PROG對(duì)凋亡的影響變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷性腦損傷后24 h皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)即有神經(jīng)細(xì)胞凋亡，腦損傷后48 h神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量達(dá)到高峰，傷后72 h有所下降，證實(shí)了腦損傷后細(xì)胞凋亡的存在。給予PROG后，發(fā)現(xiàn)Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減低，提示PROG抑制創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能是PROG腦保護(hù)作用機(jī)制之一。

有學(xué)者通過(guò)進(jìn)一步研究顯示[10]，PROG可能通過(guò)多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)作用，例如抑制自由基的產(chǎn)生、減少興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、減少血-腦脊液屏障通透性、減輕炎癥反應(yīng)、抑制腦水腫、抑制鈣超載、減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)等多種生物學(xué)效應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。PROG腦保護(hù)作用的機(jī)制尚未完全清楚，近年發(fā)現(xiàn)PROG神經(jīng)保護(hù)的作用模式，通過(guò)膜受體作用于第二信使，改變神經(jīng)元的興奮性或活化細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮非基因效應(yīng)[11]，而且，PROG作用速度快，副作用小，安全性好，易于通過(guò)血-腦脊液屏障，是一種非常有前景的腦損傷保護(hù)藥物。

[參考文獻(xiàn)]

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[10] Stein DG.Is progesterone a worthy candidate as a novel therapy for traumatic brain injury？[J].Dialogues Clin Neurosci，2011，13（3）：352-359.

[11] Cooke PS，Nanjappa MK，Yang Z，et al.Therapeutic effects of progesterone and its metabolites in traumatic brain injury may involve non-classical signaling mechanisms[J].Front Neurosci，2013，7：108-119.

（收稿日期：2014-09-12 本文編輯：許俊琴）

有學(xué)者通過(guò)進(jìn)一步研究顯示[10]，PROG可能通過(guò)多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)作用，例如抑制自由基的產(chǎn)生、減少興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、減少血-腦脊液屏障通透性、減輕炎癥反應(yīng)、抑制腦水腫、抑制鈣超載、減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)等多種生物學(xué)效應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。PROG腦保護(hù)作用的機(jī)制尚未完全清楚，近年發(fā)現(xiàn)PROG神經(jīng)保護(hù)的作用模式，通過(guò)膜受體作用于第二信使，改變神經(jīng)元的興奮性或活化細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮非基因效應(yīng)[11]，而且，PROG作用速度快，副作用小，安全性好，易于通過(guò)血-腦脊液屏障，是一種非常有前景的腦損傷保護(hù)藥物。

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（收稿日期：2014-09-12 本文編輯：許俊琴）

有學(xué)者通過(guò)進(jìn)一步研究顯示[10]，PROG可能通過(guò)多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)作用，例如抑制自由基的產(chǎn)生、減少興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、減少血-腦脊液屏障通透性、減輕炎癥反應(yīng)、抑制腦水腫、抑制鈣超載、減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)等多種生物學(xué)效應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。PROG腦保護(hù)作用的機(jī)制尚未完全清楚，近年發(fā)現(xiàn)PROG神經(jīng)保護(hù)的作用模式，通過(guò)膜受體作用于第二信使，改變神經(jīng)元的興奮性或活化細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮非基因效應(yīng)[11]，而且，PROG作用速度快，副作用小，安全性好，易于通過(guò)血-腦脊液屏障，是一種非常有前景的腦損傷保護(hù)藥物。

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[6] 楊鵬，李云，朱軍，等.亞低溫對(duì)大鼠彌漫性腦損傷后海馬CA1區(qū)Apaf-1蛋白表達(dá)和學(xué)習(xí)記憶功能的影響[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2011，10（7）：669-672.

[7] Djebaili M，Hoffman SW，Stein DG.Allopregnanolone and progesterone decrease cell death and cognitive deficits after a contusion of the rat pre-frontal cortex[J].Neuroscience，2004，123（2）：349-359.

[8] Hoffman GE，Le WW，Murphy AZ，et al.Divergent effects of ovarian steroids on neuronal survival during experimental allergic encephalitis in Lewis rats[J].Exp Neurol，2001， 171（2）：272-284.

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[10] Stein DG.Is progesterone a worthy candidate as a novel therapy for traumatic brain injury？[J].Dialogues Clin Neurosci，2011，13（3）：352-359.

[11] Cooke PS，Nanjappa MK，Yang Z，et al.Therapeutic effects of progesterone and its metabolites in traumatic brain injury may involve non-classical signaling mechanisms[J].Front Neurosci，2013，7：108-119.

（收稿日期：2014-09-12 本文編輯：許俊琴）