王梅麗+侯建明+林帆+林慶明+藍(lán)旭華+薛英

[摘要] 目的 研究乳鐵蛋白對原代大鼠成骨細(xì)胞胰島素生長因子結(jié)合蛋白-3（IGFBP-3）、胰島素生長因子結(jié)合蛋白-4（IGFBP-4）、胰島素生長因子結(jié)合蛋白-5（IGFBP-5）mRNA表達(dá)的影響。 方法 用混合酶消化法分離大鼠顱骨成骨細(xì)胞，進行原代培養(yǎng)。細(xì)胞以6×103/cm2接種于六孔板內(nèi)，用不同濃度乳鐵蛋白即0 μg/ml（對照組）、0.1 μg/ml（乳鐵蛋白1組）、1 μg/ml（乳鐵蛋白2組）、10 μg/ml（乳鐵蛋白3組）、100 μg/ml（乳鐵蛋白4組）、1000 μg/ml（乳鐵蛋白5組）干預(yù)原代大鼠成骨細(xì)胞1、3、5、7 d后提取總RNA，采用熒光定量PCR技術(shù)分析IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 與對照組比較，各濃度組及時間段對IGFBP-3 mRNA表達(dá)的影響不穩(wěn)定，時高時低。與對照組比較，除了乳鐵蛋白1組外，其他濃度對IGFBP-4 mRNA的表達(dá)呈濃度梯度的抑制（P<0.01）。與對照組比較，實驗干預(yù)第1天，呈濃度梯度抑制IGFBP-5 mRNA的表達(dá)（P<0.01），乳鐵蛋白4、5組在第5、7天表現(xiàn)為繼續(xù)抑制（P<0.01），而其他時間及濃度對IGFBP-5 mRNA的表達(dá)調(diào)控不穩(wěn)定。 結(jié)論 乳鐵蛋白影響原代大鼠成骨細(xì)胞IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表達(dá)，其中乳鐵蛋白對IGFBP-3、IGFBP-5 mRNA表達(dá)的調(diào)控不穩(wěn)定，而乳鐵蛋白抑制IGFBP-4 mRNA的表達(dá)呈濃度依賴性，濃度越高抑制作用越強。

[關(guān)鍵詞] 乳鐵蛋白；成骨細(xì)胞；胰島素生長因子結(jié)合蛋白-3；胰島素生長因子結(jié)合蛋白-4；胰島素生長因子結(jié)合蛋白-5

[中圖分類號] R329.2+4 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）11（b）-0004-05

乳鐵蛋白是一種分子量為80 kDa的鐵結(jié)合蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族，主要存在于母乳、中性粒細(xì)胞及其次級顆粒中[1]。正常情況下，乳鐵蛋白在體內(nèi)的濃度為2×106～6×106 g/ml[2]，具有免疫調(diào)節(jié)、抑菌抗炎等作用，是一種多效應(yīng)因子[3-4]。近年來，乳鐵蛋白被發(fā)現(xiàn)具有促進成骨細(xì)胞增殖和骨生長的作用。除了胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1（insulin-like growth factor binding protein 1，IGFBP-1），成骨細(xì)胞表達(dá)IGFBP-2～6，它們是六種同源異構(gòu)物[5]。大量相似的研究發(fā)現(xiàn)，成骨的增殖和骨形成受胰島素生長因子結(jié)合蛋白的調(diào)控，其中IGFBP-3，4，5很可能是發(fā)揮作用的關(guān)鍵因子。本研究通過不同濃度乳鐵蛋白作用于原代鼠成骨細(xì)胞1、3、5、7 d后用實時熒光定量PCR檢測大鼠成骨細(xì)胞IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表達(dá)，以探討乳鐵蛋白影響成骨細(xì)胞增殖及與IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5之間的關(guān)系機制。

1 材料與方法

1.1 材料

出生24 h內(nèi)的SD乳鼠（吳氏動物），牛源乳鐵蛋白（恒天然 Fonterra，純度>90%），胎牛血清（GIBCO），DMEM（GIBCO），0.25%Trypsin-EDTA（GIBCO），雙抗（青霉素、鏈霉素，Hyclon公司），堿性磷酸酶染色試劑盒（南京建成生物公司），SABC免疫組織化學(xué)試劑盒（武漢博士德公司），Ⅰ型膠原酶（Invitrogen）DMSO（GIBCO），TRIZOL（美國Invitrogen公司），RNAiso Plus（TAKARA），Primescript RT reagent kit（TAKARA：DRR037A），dH2O，引物（TAKARA），SYBR？誖 Premix Ex TaqTM Ⅱ（Perfect Real Time）（Takara Code：DRR081），反轉(zhuǎn)錄儀（Takara），實時熒光定量PCR儀（Takara），紫外分光光度計（NanoDrop ND-1000）。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠成骨細(xì)胞的培養(yǎng)

取出生24 h內(nèi)的SD乳鼠6只，頸部脫臼處死消毒，剪下頭顱浸泡于75%乙醇5 min。將頭顱置于裝有PBS的培養(yǎng)皿中，剔除顱骨的結(jié)締組織及其骨膜。用PBS沖洗骨片至發(fā)白后將其剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織片。3 ml 0.25%胰酶（含EDTA）磁粒子37℃恒溫攪拌15 min，去上清后加入0.25%胰酶和Ⅰ型膠原酶（1 ml∶4 ml）混合物，再次37℃恒溫攪拌消化60 min。取上清，1000 r/min離心10 min后棄上清。取10%完全培養(yǎng)液6 ml重懸，一分為二置于兩個培養(yǎng)瓶中，10 min差速貼壁分離成纖維細(xì)胞兩次后置于37℃、濕度5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 成骨細(xì)胞的鑒定

1.2.2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及生長狀況。

1.2.2.2 堿性磷酸酶染色 采用偶氮偶聯(lián)法，將二代細(xì)胞接種于5 cm×5 cm無菌蓋玻片上，置于6孔板培養(yǎng)。固定：取出細(xì)胞爬片用固定液固定3 min左右；加底物應(yīng)用液：在固定后的細(xì)胞爬片上滴加新鮮配制的底物應(yīng)用液并蓋滿樣本部分，加蓋疏水膜，放置濕盒中，避光37℃孵育15 min，水洗；復(fù)染：用蘇木素或甲基綠染3 min，水洗，鏡檢，拍照。

1.2.2.3 Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)（SABC法） 取出提前制備好的密度均勻的細(xì)胞爬片，PBS洗3遍，5 min/次，用多聚甲醛固定30 min；吸出固定用的多聚甲醛，用PBS洗3遍，5 min/次，用蒸餾水洗3次，2 min/次；用3%H2O2去離子水室溫孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；蒸餾水浸泡沖洗5 min；滴加封閉山羊血清工作液，室溫下孵育15 min，甩去多余液體勿洗；滴加稀釋的一抗，即兔抗大鼠的Ⅰ型膠原抗體，濃度為1∶100，37℃孵育2～3 h或4℃過夜（對照組不加一抗，用蒸餾水代替）；PBS沖洗3 min×3次，加入生物素標(biāo)記山羊抗兔二抗；20～37℃孵育20 min，用PBS洗2 min×3次；滴加試劑SABC，20～37℃孵育20 min，PBS洗5 min×4次；DAB顯色：取1 ml蒸餾水，加入試劑盒中A、B、C液各1滴，混勻后加至細(xì)胞爬片，室溫下顯色，鏡下控制反應(yīng)時間（5～30 min），蒸餾水沖洗；鏡下觀察染色情況并拍照。

1.2.3 實驗分組

實驗根據(jù)乳鐵蛋白濃度共分為6組，分別為對照組（0 μg/ml）、乳鐵蛋白1組（0.1 μg/ml）、乳鐵蛋白2組（1 μg/ml）、乳鐵蛋白3組（10 μg/ml）、乳鐵蛋白4組（100 μg/ml）、乳鐵蛋白5組（1000 μg/ml）。

1.2.4 實時熒光定量PCR測定IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的相對表達(dá)量

1.2.4.1 引物的設(shè)計和合成 引物詳細(xì)信息從GenBank獲取，引物合成由TAKARA Biotechnology （Dalian）Co.，Ltd.完成。引物序列和分子量見表1。

1.2.4.2 總RNA的提取和cDNA的合成 貼壁細(xì)胞總RNA的提取按照RNAiso Plus（Takara code：D9108A）的操作說明書提取，用紫外分光光度計檢測濃度和純度，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定完整性。參照Primescript RT reagent kit （Takara公司）說明書配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，在反轉(zhuǎn)錄儀上進行cDNA的合成。

1.2.4.3 實時熒光定量Real Time PCR反應(yīng) 根據(jù)說明書配制PCR反應(yīng)液后在擴增儀上進行PCR反應(yīng)。PCR擴增標(biāo)準(zhǔn)程序：Stage one：預(yù)變性（Repeat 1），95℃ 30 s。Stage two：PCR 反應(yīng)（Repeat 40），95℃ 5 s；60℃ 30 s（熒光信號采集）。Stage three：融解曲線分析（Repeat 1），95℃ 15 s；60℃ 30 s；95℃，15 s熒光信號采集。

根據(jù)Real Time PCR反應(yīng)結(jié)果中的Ct值，進行mRNA的相對表達(dá)量計算，每組設(shè)3個平行孔，實驗分別重復(fù)3次。mRNA的相對表達(dá)量計算：設(shè)定對照組相對表達(dá)量為1，表達(dá)差異計算：=2-ΔΔCt。ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct管家基因）對照組。2-ΔΔCt表示的是實驗組目的基因的表達(dá)相對于對照組的變化倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 相差顯微鏡下的原代大鼠成骨細(xì)胞（染色前）

在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞完全伸展，折光性好，可見胞核及胞質(zhì)，體積較大，胞質(zhì)豐富，多為單核，有多邊形、長梭型及三角形，呈“鋪路石樣”排列，胞質(zhì)向外伸展，并伸出突觸，符合成骨細(xì)胞的特征（圖1）。

2.2 成骨細(xì)胞鑒定

2.2.1 SABC：Ⅰ型膠原酶免疫組織化學(xué)結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果陽性，胞質(zhì)被染成棕黃色，符合成骨細(xì)胞特征（圖2）。

2.2.2 ALP鑒定結(jié)果

倒置相差顯微鏡下可見細(xì)胞呈典型成骨細(xì)胞特征，貼壁生長，體積較大，胞質(zhì)豐富，形態(tài)不規(guī)則，多為單核，有1～3個核仁，細(xì)胞呈三角形、多邊形、長梭形等，呈“鋪路石樣”排列，胞質(zhì)向外伸展，并伸出突觸。堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示，細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，胞質(zhì)中有咖啡色顆粒，有少量顆粒分散在細(xì)胞周圍，符合成骨細(xì)胞特征（圖3）。

2.3 不同濃度乳鐵蛋白干預(yù)原代大鼠成骨細(xì)胞1、3、5、7 d后對IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA表達(dá)的影響

2.3.1 IGFBP-3 mRNA的表達(dá)

第1天，乳鐵蛋白1～5組與對照組比較，乳鐵蛋白4、5組抑制了IGFBP-3 mRNA的表達(dá)；第3天差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；第5天，乳鐵蛋白1～4組與對照組比較，抑制了IGFBP-3 mRNA的表達(dá)，而乳鐵蛋白5組又促進了其表達(dá)，但是促進趨勢不高；第7天，乳鐵蛋白3、4組與對照組比較，抑制了IGFBP-3 mRNA的表達(dá)，而乳鐵蛋白5組又促進了其表達(dá)（表2）?？梢?，乳鐵蛋白對IGFBP-3 mRNA表達(dá)的調(diào)控不穩(wěn)定，與時間和濃度不呈一定規(guī)律性。

2.3.2 IGFBP-4 mRNA的表達(dá)

第1、5天，與對照組比較，除了乳鐵蛋白1組外，其他各組對IGFBP-4 mRNA的表達(dá)呈一定濃度梯度的抑制（P<0.05）；第3天，乳鐵蛋白1～5組較對照組均抑制mRNA的表達(dá)（P<0.01），呈一定濃度梯度的抑制；第7天乳鐵蛋白1～3組較對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而乳鐵蛋白4、5組較對照組有抑制mRNA表達(dá)的趨勢（P<0.05），乳鐵蛋白5組抑制作用最強（P<0.01）（表3）?？芍殍F蛋白抑制了IGFBP-4 mRNA的表達(dá)，呈濃度依賴性。

2.3.3 IGFBP-5 mRNA的表達(dá)

第1天，與對照組比較，乳鐵蛋白1～5組對IGFBP-5 mRNA的表達(dá)主要起抑制作用（P<0.01）；第3天，與對照組比較，乳鐵蛋白1、2組促進了IGFBP-5 mRNA的表達(dá)，但是趨勢較弱；第5天，乳鐵蛋白4、5組與對照組比較，抑制了IGFBP-5 mRNA的表達(dá)（P<0.01）；第7天，與對照組比較，除了乳鐵蛋白3組，各組抑制了IGFBP-5 mRNA的表達(dá)（P<0.01）（表4）?？芍?，乳鐵蛋白對IGFBP-5 mRNA的表達(dá)主要為抑制作用，呈一定濃度依賴性，但是調(diào)控不穩(wěn)定，沒有一定的規(guī)律性。

3 討論

乳鐵蛋白是一種鐵結(jié)合蛋白，主要存在于母乳、中性粒細(xì)胞及其次級顆粒中[1]，近年來被發(fā)現(xiàn)有促進成骨細(xì)胞增殖的作用[5-6]。Cornish等[7]利用培養(yǎng)3周的原代大鼠成骨細(xì)胞研究以評估骨小結(jié)形成，骨小結(jié)形成包括分化的成骨細(xì)胞的兩種骨形成活動即骨基質(zhì)沉積和礦化，研究發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白劑量依賴性地增加骨小結(jié)數(shù)量及骨礦化區(qū)。同時，本課題前期研究[8]發(fā)現(xiàn)不同濃度乳鐵蛋白干預(yù)原代大鼠成骨細(xì)胞1、3、5、7 d后具有促進成骨細(xì)胞增殖的作用。目前，乳鐵蛋白作用的分子機制大部分仍未清楚。最近，有研究用芯片技術(shù)研究乳鐵蛋白對成骨細(xì)胞基因表達(dá)的改變，發(fā)現(xiàn)上調(diào)了人原代成骨細(xì)胞胰島素樣生長因子1（IGF-1）mRNA的表達(dá)[9]，成骨細(xì)胞IGF-1表達(dá)上調(diào)后，與IGF-1受體（IGF-1R）結(jié)合，引起胰島素受體底物1（IRS-1）磷酸化，再激活PI3K依賴的Akt，最后促進成骨細(xì)胞增殖和存活。但是，激活這條信號通路的前提是IGF-1與胰島素生長因子結(jié)合蛋白（IGFBPs）分離，這樣游離的IGF-1才能與IGF-1R結(jié)合[10]。并且生理條件下，IGFBPs比IGF-1更加嚴(yán)密調(diào)控著成骨細(xì)胞的增殖與骨形成[11]。故而，關(guān)于IGFBPs與成骨細(xì)胞增殖和骨形成的相關(guān)研究不斷涌出。有研究指出持續(xù)過表達(dá)IGFBP-3的轉(zhuǎn)基因小鼠，被發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞數(shù)量和骨吸收明顯增加，而抑制了成骨細(xì)胞的增殖和骨形成[12]。同時，有研究用rhIGF-1/IGFBP-3復(fù)合物發(fā)現(xiàn)有促進骨形成的作用[13]。與骨相鄰的腫瘤細(xì)胞可以釋放IGFBP-4，其可能抑制IGF-1促進成骨細(xì)胞增殖的作用，并且導(dǎo)致骨形成減少[14]。也有研究指出IGFBP-5可促進IGF-1對成骨細(xì)胞的刺激作用[11]。分別向敲除IGF-1的成骨細(xì)胞和野生型小鼠成骨細(xì)胞內(nèi)添加IGFBP-5后，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞增殖以及骨形成標(biāo)記的ALP活性和骨鈣素的表達(dá)增加。同樣的，分別在敲除IGF-1和野生型小鼠顱骨外骨膜上局部注射rhIGFBP-5后，骨形成系數(shù)和標(biāo)志ALP以及骨鈣素增加[15]。有體外研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)IGFBP-5的小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3卻發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞功能降低，骨形成標(biāo)記和骨基質(zhì)形成減少[16]?？梢?，IGFBPs在影響成骨細(xì)胞增殖和骨形成的作用上存在爭議。但是，不可否認(rèn)的是IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5在調(diào)控骨量和影響成骨細(xì)胞增殖方面可能發(fā)揮著重要作用。

故而，根據(jù)一系列研究，本研究提出乳鐵蛋白是否可以通過影響IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5的表達(dá)而達(dá)到調(diào)控骨量和影響成骨細(xì)胞增殖的作用這一問題。然而要證明這點，首先得探索乳鐵蛋白是否影響了IGFBPs的表達(dá)。正如本研究結(jié)果顯示乳鐵蛋白影響原代大鼠成骨細(xì)胞IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表達(dá)。其中，乳鐵蛋白對IGFBP-3、IGFBP-5 mRNA的表達(dá)的調(diào)控不穩(wěn)定，不同時間及濃度的干預(yù)對其的表達(dá)沒有一定的規(guī)律性。對IGFBP-4 mRNA的表達(dá)的影響呈時間和濃度的依賴性，濃度越高抑制作用越強，故而進一步猜測乳鐵蛋白影響胰島素生長因子結(jié)合蛋白的表達(dá)可能在乳鐵蛋白調(diào)控骨量和影響成骨細(xì)胞增殖方面可能發(fā)揮著重要作用。但是，IGFBP-3、-4、-5在蛋白水平是否受到影響未可知。其次，是否體內(nèi)研究也同樣受到影響。因乳鐵蛋白可上調(diào)IGF-1[9]，那么要證明乳鐵蛋白是通過調(diào)控IGFBPs來促進成骨細(xì)胞增殖的前提得先排除IGF-1的影響。此外，IGFBPs具有獨立作用[10]，即不依賴IGF-1的影響成骨細(xì)胞的作用，那乳鐵蛋白是否只是通過影響IGFBP單條途徑影響成骨細(xì)胞的增殖也未可知。想要回答以上問題，可繼續(xù)進行體外研究乳鐵蛋白對IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5蛋白表達(dá)的影響，另外通過體內(nèi)研究進一步佐證。實驗發(fā)現(xiàn)，乳鐵蛋白抑制了IGFBP-4 mRNA的表達(dá)，則可通過腺病毒過表達(dá)IGFBP-4以進一步確定IGFBP-4乳鐵蛋白是否通過抑制其表達(dá)而達(dá)到促進成骨細(xì)胞增殖的作用。此外，為排除IGF-1促成骨細(xì)胞的作用，可利用基因沉默技術(shù)，沉默IGF-1來證實。

綜上所述，本研究證實乳鐵蛋白影響IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表達(dá)，若能進一步研究出乳鐵蛋白調(diào)控骨量和影響成骨細(xì)胞增殖與IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5之間的關(guān)系，將給臨床提供更多治療骨質(zhì)疏松的藥物靶點。

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（收稿日期：2014-08-06 本文編輯：郭靜娟）

故而，根據(jù)一系列研究，本研究提出乳鐵蛋白是否可以通過影響IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5的表達(dá)而達(dá)到調(diào)控骨量和影響成骨細(xì)胞增殖的作用這一問題。然而要證明這點，首先得探索乳鐵蛋白是否影響了IGFBPs的表達(dá)。正如本研究結(jié)果顯示乳鐵蛋白影響原代大鼠成骨細(xì)胞IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表達(dá)。其中，乳鐵蛋白對IGFBP-3、IGFBP-5 mRNA的表達(dá)的調(diào)控不穩(wěn)定，不同時間及濃度的干預(yù)對其的表達(dá)沒有一定的規(guī)律性。對IGFBP-4 mRNA的表達(dá)的影響呈時間和濃度的依賴性，濃度越高抑制作用越強，故而進一步猜測乳鐵蛋白影響胰島素生長因子結(jié)合蛋白的表達(dá)可能在乳鐵蛋白調(diào)控骨量和影響成骨細(xì)胞增殖方面可能發(fā)揮著重要作用。但是，IGFBP-3、-4、-5在蛋白水平是否受到影響未可知。其次，是否體內(nèi)研究也同樣受到影響。因乳鐵蛋白可上調(diào)IGF-1[9]，那么要證明乳鐵蛋白是通過調(diào)控IGFBPs來促進成骨細(xì)胞增殖的前提得先排除IGF-1的影響。此外，IGFBPs具有獨立作用[10]，即不依賴IGF-1的影響成骨細(xì)胞的作用，那乳鐵蛋白是否只是通過影響IGFBP單條途徑影響成骨細(xì)胞的增殖也未可知。想要回答以上問題，可繼續(xù)進行體外研究乳鐵蛋白對IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5蛋白表達(dá)的影響，另外通過體內(nèi)研究進一步佐證。實驗發(fā)現(xiàn)，乳鐵蛋白抑制了IGFBP-4 mRNA的表達(dá)，則可通過腺病毒過表達(dá)IGFBP-4以進一步確定IGFBP-4乳鐵蛋白是否通過抑制其表達(dá)而達(dá)到促進成骨細(xì)胞增殖的作用。此外，為排除IGF-1促成骨細(xì)胞的作用，可利用基因沉默技術(shù)，沉默IGF-1來證實。

綜上所述，本研究證實乳鐵蛋白影響IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表達(dá)，若能進一步研究出乳鐵蛋白調(diào)控骨量和影響成骨細(xì)胞增殖與IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5之間的關(guān)系，將給臨床提供更多治療骨質(zhì)疏松的藥物靶點。

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（收稿日期：2014-08-06 本文編輯：郭靜娟）

故而，根據(jù)一系列研究，本研究提出乳鐵蛋白是否可以通過影響IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5的表達(dá)而達(dá)到調(diào)控骨量和影響成骨細(xì)胞增殖的作用這一問題。然而要證明這點，首先得探索乳鐵蛋白是否影響了IGFBPs的表達(dá)。正如本研究結(jié)果顯示乳鐵蛋白影響原代大鼠成骨細(xì)胞IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表達(dá)。其中，乳鐵蛋白對IGFBP-3、IGFBP-5 mRNA的表達(dá)的調(diào)控不穩(wěn)定，不同時間及濃度的干預(yù)對其的表達(dá)沒有一定的規(guī)律性。對IGFBP-4 mRNA的表達(dá)的影響呈時間和濃度的依賴性，濃度越高抑制作用越強，故而進一步猜測乳鐵蛋白影響胰島素生長因子結(jié)合蛋白的表達(dá)可能在乳鐵蛋白調(diào)控骨量和影響成骨細(xì)胞增殖方面可能發(fā)揮著重要作用。但是，IGFBP-3、-4、-5在蛋白水平是否受到影響未可知。其次，是否體內(nèi)研究也同樣受到影響。因乳鐵蛋白可上調(diào)IGF-1[9]，那么要證明乳鐵蛋白是通過調(diào)控IGFBPs來促進成骨細(xì)胞增殖的前提得先排除IGF-1的影響。此外，IGFBPs具有獨立作用[10]，即不依賴IGF-1的影響成骨細(xì)胞的作用，那乳鐵蛋白是否只是通過影響IGFBP單條途徑影響成骨細(xì)胞的增殖也未可知。想要回答以上問題，可繼續(xù)進行體外研究乳鐵蛋白對IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5蛋白表達(dá)的影響，另外通過體內(nèi)研究進一步佐證。實驗發(fā)現(xiàn)，乳鐵蛋白抑制了IGFBP-4 mRNA的表達(dá)，則可通過腺病毒過表達(dá)IGFBP-4以進一步確定IGFBP-4乳鐵蛋白是否通過抑制其表達(dá)而達(dá)到促進成骨細(xì)胞增殖的作用。此外，為排除IGF-1促成骨細(xì)胞的作用，可利用基因沉默技術(shù)，沉默IGF-1來證實。

綜上所述，本研究證實乳鐵蛋白影響IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表達(dá)，若能進一步研究出乳鐵蛋白調(diào)控骨量和影響成骨細(xì)胞增殖與IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5之間的關(guān)系，將給臨床提供更多治療骨質(zhì)疏松的藥物靶點。

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（收稿日期：2014-08-06 本文編輯：郭靜娟）