潘磊 ，李依 ，郭瑞 ，張鳳銀 ，曾長立 ，胡志輝 ，吳華 ，陳禪友

（1.湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心，武漢，430056；2.江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院）

豇豆（Vigna unguiculata）（2n=2x=22），又名豆角、長豆角、帶豆等，屬豆科豇豆屬一年生草本植物。豇豆起源于非洲，中國是其次生起源中心，它在我國栽培歷史悠久，栽培面積大，南北各地均有分布。當(dāng)前，豇豆的DNA分子標(biāo)記研究在國內(nèi)外越來越受到關(guān)注[1]。特別是在豇豆的遺傳多樣性及品種（系）間的遺傳關(guān)系等研究方面，開展了多種分子標(biāo)記技術(shù)的研究，如RFLP[2]，AFLP[3]，RAPD（Random amplified polymorphic DNA，隨機擴(kuò)增多態(tài)性 DNA）[4，5]、ISSR（Inter－simple sequence repeat，簡單序列重復(fù)區(qū)間）[6]。 近年來，借助比較基因組學(xué)的技術(shù)手段，研究者們將豇豆近緣種——普通豇豆SNP（Single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）[7]和普通豇豆SSR（Simple sequence repeat，簡單序列重復(fù)）[8，9]等分子標(biāo)記，成功用于長豇豆基因組的研究。

然而，豇豆核外基因組微衛(wèi)星標(biāo)記的研究，特別是葉綠體微衛(wèi)星（Chloroplast simple sequence repeat，cpSSR）標(biāo)記的發(fā)掘及其應(yīng)用研究尚未見報道。Powell等[10]首次提出葉綠體cpSSR標(biāo)記技術(shù)。與核基因組SSR標(biāo)記相比，葉綠體基因組DNA（Chloroplast genome DNA，cpDNA） 呈單親遺傳模式、結(jié)構(gòu)簡單、多拷貝、分子量小等特點，此外，cpSSR標(biāo)記還兼有核基因組SSR標(biāo)記的共顯性、高度變異和多態(tài)性等特點，可以用于種質(zhì)資源分類[11]、親緣關(guān)系鑒定[12]、遺傳多樣性[13，14]、遺傳結(jié)構(gòu)[15]、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)等研究[16，17]。

開發(fā)cpSSR標(biāo)記的傳統(tǒng)策略是構(gòu)建基因組文庫和測序，然后設(shè)計引物進(jìn)行篩選，以獲得cpSSR引物，但是從植物組織中提取高純度cpDNA十分困難，而且費時費力。當(dāng)前，采用生物信息學(xué)技術(shù)方法，充分發(fā)掘公共數(shù)據(jù)庫資源中的葉綠體基因組序列，根據(jù)cpSSR側(cè)翼序列的保守性，設(shè)計篩選cpSSR引物是一條經(jīng)濟(jì)且便捷的途徑。

雖然豇豆全基因組測序尚未完成，但是豇豆葉綠體全基因組已經(jīng)測序完成并公布。本研究通過下載公共數(shù)據(jù)庫中的豇豆葉綠體基因組全序列，分析豇豆葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)和組分特征，揭示豇豆cpSSR組成與分布特點，并檢驗豇豆cpSSR引物在豆科物種間的通用性，以便為豇豆cpSSR標(biāo)記在其近緣種的群體分化、遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 葉綠體微衛(wèi)星篩選

從 GenBank公共數(shù)據(jù)庫中（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載豇豆（V.unguiculata）葉綠體基因組全序列（NC_018051），對豇豆葉綠體基因組全序列進(jìn)行分析，篩選微衛(wèi)星序列。單堿基微衛(wèi)星采用軟件Tandem Repeats Finder 4.04查找[18]；多堿基微衛(wèi)星采用SSRhunter 1.3軟件進(jìn)行分析[19]，搜索條件按設(shè)置為單堿基微衛(wèi)星最小重復(fù)次數(shù)為10、二和三堿基的完全重復(fù)微衛(wèi)星最小重復(fù)次數(shù)分別為5和4、四堿基及四堿基以上的微衛(wèi)星最小重復(fù)次數(shù)均為3。在每個SSR位點的上下游側(cè)翼序列各為150 bp。

此外，采用DOGMA軟件 （Dual Organellar Genome Annotator）（http://dogma.ccbb.utexas.edu/）對葉綠體基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.2 cpSSR引物設(shè)計

基于所獲得的葉綠體微衛(wèi)星序列，利用在線引物設(shè)計軟件 Primer 3.0（http://frodo.wi.mit.edu/）分析微衛(wèi)星的側(cè)翼序列并進(jìn)行引物設(shè)計。主要參數(shù)設(shè)置為引物長度18～22 bp，以20 bp為最佳；引物退火溫度50～60℃，以55℃為最佳，上游和下游的引物退火溫度之差在5℃以內(nèi)；GC含量40%～70%，最適為50%；預(yù)期PCR產(chǎn)物長度為100～400 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 供試的豆類樣本材料

本研究在對引物進(jìn)行擴(kuò)增檢測時，采用了19份豆類種質(zhì)資源，包括10份豇豆材料，5份菜豆材料，3份豌豆材料和1份利馬豆材料（表1）。

1.4 PCR擴(kuò)增和電泳分析

PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，含有1×PCR buffer，20 ng DNA 模 板 ，4 nmol dNTP，30 nmol MgCl2，引物 10 pmol，0.5 U Taq DNA 聚合酶[天根生化科技（北京）有限公司]。在Mastercycler gradient型PCR儀（德國，Eppendorf公司）上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5 min；然后進(jìn)行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括 94℃變性 30 s，50～60℃退火 30 s，72℃延伸 40 s；最后 72℃延伸 5 min。

采用8%變性聚丙烯酰胺凝膠（Acrylamide∶Bis=19∶1）檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液（98%甲酰胺，10 mmol/L EDTA，0.025%溴酚藍(lán)和0.025%二甲苯青藍(lán)）等體積混合，在95°C變性5 min后，立即冰浴3 min，每次點樣量2.5 μL，恒功率55 W預(yù)電泳40 min，然后恒功率50 W電泳1.5 h。電泳完畢，經(jīng)過固定、銀染、顯色并用數(shù)碼相機拍照。

表1 供試的豆類樣品信息

表2 52個cpSSR在豇豆葉綠體基因組上的分布

電泳后，統(tǒng)計每一樣品擴(kuò)增的DNA條帶數(shù)及其多態(tài)性，在同一電泳遷移位置上，有DNA擴(kuò)增條帶記為“1”，無條帶記為“0”。

2 結(jié)果與分析

2.1 豇豆葉綠體基因組cpSSR的分布

豇豆葉綠體基因組全序列分析表明，其基因組大小為152 415 bp，總GC含量為35.2%。豇豆葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)包括1個長單拷貝序列（Long single copy sequence，LSC）、1個短單拷貝序列 （Short singlecopysequence，SSC）及 2 個反向重復(fù)序列（Inverted repeat，IR）。其中，LSC約81 kb分布區(qū)域為1～81 468 bp，IRa約 26 kb分布區(qū)域為 81 469～107 351 bp，SSC 約 19 kb分 布 區(qū) 為 107 352～126 250 bp，IRb大約26 kb分布區(qū)域為126 251～152 415 bp。

從豇豆葉綠體基因組上共搜索出52個微衛(wèi)星（表2），分布頻率為每2 931 bp有1個 cpSSR；微衛(wèi)星核心重復(fù)區(qū)及側(cè)翼序列總長度為16 213 bp，占基因組全長的10.63%。豇豆cpSSR的分布范圍較大，從7 245 bp到152 001 bp都有分布，但是其分布并不均勻，主要集中在LSC區(qū)，少量的在SSC區(qū) ，而在IR區(qū)沒有。在LSC區(qū)和SSC區(qū)分布的cpSSR分別為48個（92.3%）和 4個（7.7%）。

表3 52個豇豆葉綠體cpSSR的重復(fù)基序特點

2.2 豇豆葉綠體基因組cpSSR的重復(fù)基序特點

根據(jù)微衛(wèi)星核心重復(fù)基序的結(jié)構(gòu)特點[20]，可將微衛(wèi)星可分為3種類型，即完美型、非完美型和復(fù)合型。完美型指的是微衛(wèi)星序列沒有中斷或附近沒有其他種類基序的重復(fù)序列；非完美型指的是同種重復(fù)基序被3個堿基以下的非重復(fù)序列所間隔；復(fù)合型指一種重復(fù)基序與其他種類的重復(fù)基序被3個以下的非重復(fù)序列所間隔。在所獲得的52個豇豆cpSSR中，完美型為48個，非完美型為4個，無復(fù)合型（表3）。這表明，在豇豆葉綠體基因組cpSSR中以完美型和非完美型微衛(wèi)星為主。此外，對核心區(qū)的重復(fù)次數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，重復(fù)次數(shù)的變化范圍為4～19次，其中核心重復(fù)次數(shù)為10次的微衛(wèi)星有14個（26.9%），而核心重復(fù)次數(shù)為11次的微衛(wèi)星有11個（21.2%），兩者累計所占比例為48.1%，幾乎占全部微衛(wèi)星數(shù)量的1/2。

依據(jù)重復(fù)基序的堿基數(shù)目差別，在這52個豇豆cpSSR中，單堿基重復(fù)基序微衛(wèi)星共有33個（完美型29個和非完美型4個），占63.5%，而 A和T是單堿基重復(fù)基序的主要類型，未見C或者G的單堿基基序（表3）。二堿基重復(fù)基序的微衛(wèi)星有14個，占26.9%，以AT和TA為主；三堿基重復(fù)基序有5個，占9.6%，堿基類型包括AAT （2個）、TTA（1個）、TAA（1 個）、ATA（1 個）。 由此可見，在豇豆葉綠體微衛(wèi)星中，重復(fù)基序的堿基主要以A和T為主。

2.3 cpSSR引物的設(shè)計與篩選

利用在線引物設(shè)計軟件Primer 3.0分析上述52個豇豆葉綠體微衛(wèi)星序列，從中設(shè)計并合成10對cpSSR引物，通過對10份豇豆樣品的PCR檢測，發(fā)現(xiàn)其中8對cpSSR引物具有多態(tài)性（圖1），且PCR產(chǎn)物片段位于100～400 bp（表4）。

檢測上述8對多態(tài)性豇豆cpSSR在其近緣種中的可轉(zhuǎn)移性（圖2）。選取豇豆的3個近緣物種豌豆、利馬豆和菜豆（共9份樣品）進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，這8對豇豆cpSSR引物均可以在這三3個近緣種中成功擴(kuò)增（表4）。

圖1 引物CPM7在10份豇豆樣品中擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜（8%PAGE）

在豌豆中具有多態(tài)性的引物有CPM1、CPM3和CPM6，均檢測到2個等位基因，其余5對cpSSR引物為單態(tài)性；在菜豆中具有多態(tài)性的引物有CPM1、CPM2、CPM4、CPM5 和 CPM7，也均檢測到 2對等位基因，而其余3對cpSSR引物為單態(tài)性。

3 討論與結(jié)論

葉綠體基因組是單倍體，保守性較強，具有細(xì)胞質(zhì)遺傳的特點，除少數(shù)植物例外，一般為單親遺傳，不發(fā)生重組[21]。由于在進(jìn)化過程中，親代到子代的遺傳物質(zhì)傳遞不涉及基因組重組，不會受到選擇壓力，而且位點發(fā)生的突變也容易保留，不會受到重組、缺失以及假基因等的干擾[22]。因此，具有葉綠體基因組特征的cpSSR分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于在植物種質(zhì)資源鑒定、群體分化、系統(tǒng)分類和物種進(jìn)化等研究領(lǐng)域[23，24]。

表4 8個豇豆cpSSR引物信息及在其近緣種中的可轉(zhuǎn)移性

圖2 引物CPM7在豌豆、利馬豆和菜豆樣品中擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜（8%PAGE）

在cpSSR分子標(biāo)記的應(yīng)用上，其瓶頸和難點是引物的設(shè)計與篩選。與核基因組SSR引物的開發(fā)類似，cpSSR引物開發(fā)的前提是獲取微衛(wèi)星側(cè)翼的序列信息。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和基因組學(xué)的不斷進(jìn)步，當(dāng)前cpSSR分子標(biāo)記的開發(fā)主要有兩種策略，一是直接進(jìn)行葉綠體基因組測序，再設(shè)計篩選cpSSR引物；二是基于生物信息學(xué)手段，或者從公共數(shù)據(jù)庫的葉綠體基因組中發(fā)掘cpSSR引物，或者利用近緣物種的cpSSR進(jìn)行種間的可轉(zhuǎn)移性檢測，以獲取cpSSR引物。對于前者而言，由于葉綠體基因組DNA的分離和純化難度較大，增加了測序難度和成本，因此，后者利用公共數(shù)據(jù)庫資源進(jìn)行葉綠體cpSSR標(biāo)記的開發(fā)，更加簡便和經(jīng)濟(jì)。特別是隨著開展全基因組測序的植物物種越來越多，許多植物的葉綠體基因組如擬南芥[25，26]、黃瓜[22]、蝴蝶蘭[27]、柑橘[28，29]、菜豆[30]等的全序列或者部分序列已經(jīng)釋放到公共數(shù)據(jù)庫中，極大促進(jìn)了cpSSR分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用。

豇豆的葉綠體基因組全序列剛公布不久，這為揭示豇豆葉綠體基因組特征，并開發(fā)豇豆cpSSR分子標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。豇豆葉綠體基因組比較大（約153 kb），而一般植物的葉綠體基因組大小在120～170 kb[7，31]。

本研究通過對豇豆葉綠體全基因進(jìn)行微衛(wèi)星分布特征分析，發(fā)現(xiàn)在豇豆葉綠體基因組上分布有52個cpSSR，其序列總長約占葉綠體基因組全長的1/10。這些微衛(wèi)星在豇豆葉綠體基因組上分布不均，分布的密集區(qū)域為LSC區(qū)，只有少數(shù)幾個微衛(wèi)星分布在SSC區(qū)，而在IR區(qū)無微衛(wèi)星分布。

這52個豇豆cpSSR在微衛(wèi)星的序列特征上，以A/T為單堿基重復(fù)基序的微衛(wèi)星為主 （63.5%），也包括少量的二堿基重復(fù)基序類型AT/TA和三堿基重復(fù)基序類型AAT/TTA/TAA/ATA；重復(fù)次數(shù)的變化范圍為4次到19次不等。因此，在豇豆cpSSR中，無論單堿基、二堿基或者三堿基重復(fù)基序，它們的堿基組成均以A/T為主要類型，未見C/G的堿基基序，而且重復(fù)次數(shù)變異范圍有限。cpSSR的這種堿基組成和重復(fù)特征可能與葉綠體的結(jié)構(gòu)組成特點及其進(jìn)化有關(guān)聯(lián)。

由于葉綠體基因組序列在物種間具有較高的保守性，cpSSR引物可以在不同種屬間進(jìn)行跨種擴(kuò)增，具有通用性。Ishii等[32]研究表明，水稻cpSSR標(biāo)記在禾本科植物中具有較為廣泛的通用性。Diekmann等[33]從多年生黑麥草中發(fā)掘出9個cpSSR標(biāo)記并檢驗其在黑麥草屬物種中的通用性。在園藝作物研究中，梁芳芳等[34]發(fā)現(xiàn)黃瓜cpSSR引物在其近緣種甜瓜、南瓜和西瓜中的通用性較好；Xue等[35]研究了中國蓮cpSSR在蓮屬中的通用性及多態(tài)性；Jiang等[36]從中國芒中開發(fā)出了在芒屬植物中具有通用性的cpSSR引物。而在木本植物研究中，韓鍵等[37]研究揭示了果梅cpSSR引物在李屬的桃、李、梅、杏、櫻桃等5個樹種中均具有通用性。

關(guān)于豆科植物的cpSSR分子標(biāo)記研究鮮見報道。Angioi等[38]報道了所開發(fā)的菜豆屬cpSSR標(biāo)記的通用性，并分析了其在豆科的羽扇豆、花生、蒺藜苜蓿、鷹嘴豆、大豆和豌豆中的通用性。當(dāng)前，對豇豆葉綠體基因組cpSSR分子標(biāo)記的研究尚未見正式報道。

因此，本研究初步嘗試對豇豆cpSSR分子標(biāo)記進(jìn)行研究，設(shè)計篩選了8對多態(tài)性豇豆cpSSR引物，并在豇豆的近緣種豌豆、利馬豆和菜豆中成功擴(kuò)增，表明了這些cpSSR引物在不同豆類物種之間具有較為廣泛的通用性?？傊狙芯糠治隽唆够蚪M微衛(wèi)星的序列組成和分布特點，并成功開發(fā)出具有種間通用性的豇豆cpSSR引物，這將為豇豆cpSSR分子標(biāo)記應(yīng)用于豆科物種開展群體遺傳學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化等研究奠定一定的基礎(chǔ)。

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