劉紅軍，朱紅梅，程祝強(qiáng)，金 毅，徐建國(guó)

嗎啡是腫瘤患者術(shù)后鎮(zhèn)痛和癌痛治療常用藥物，研究表明嗎啡在鎮(zhèn)痛同時(shí)可對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響，其機(jī)制可能與抑制自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)活性等有關(guān)［1-4］。鑒于嗎啡具有免疫抑制作用，許多其他藥物亦被用于替代嗎啡鎮(zhèn)痛。其中曲馬多由于鎮(zhèn)痛效果好，不良反應(yīng)小而被廣泛使用［5］。有研究［5-6］認(rèn)為，等效鎮(zhèn)痛劑量的曲馬多和嗎啡相比，可有效減輕手術(shù)應(yīng)激和疼痛所致的免疫抑制，并且曲馬多不會(huì)對(duì)細(xì)胞免疫功能產(chǎn)生抑制作用，相反可增強(qiáng)NK細(xì)胞活性和促進(jìn)白細(xì)胞介素-2(IL-2)的產(chǎn)生。但腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移除了機(jī)體抗腫瘤免疫機(jī)制的間接作用外，還與腫瘤細(xì)胞自身的生長(zhǎng)增殖能力有關(guān)。既往研究表明嗎啡可與細(xì)胞表面阿片受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)，但具體機(jī)制仍不清楚［7-8］;關(guān)于曲馬多對(duì)腫瘤細(xì)胞增增殖和凋亡的影響尚無(wú)研究。因此本研究擬通過(guò)離體實(shí)驗(yàn)，研究等效鎮(zhèn)痛劑量嗎啡和曲馬多對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與器材 硫酸嗎啡、β-Actin鼠源單抗(美國(guó)Sigama公司);曲馬多(德國(guó)格蘭泰有限公司);大鼠乳腺癌細(xì)胞系 MADB106(上海通派生物科技有限公司);Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、RPMI-1640(美國(guó)GIBCO公司);FBS(美國(guó)ExCell Biology公司);MTT(美國(guó)Amresco公司);96孔、24孔與6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Corning Incorporated公司);半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)抗體、半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)抗體、激活型caspase-3抗體、激活型caspase-8抗體(美國(guó)Cellsignaling公司)。圖像分析軟件Image J(NIH公司);垂直電泳槽(Bio-Rad公司);超凈工作臺(tái)(中國(guó)蘇州凈化 SW-CJ-1FD);CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司);EL-x800酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton-Dickinson公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 MADB-106乳腺癌細(xì)胞株經(jīng)含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基在37℃，濕度為95%，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。組別:空白對(duì)照組，溶劑對(duì)照組，嗎啡Ⅰ組(1 nM)，嗎啡Ⅱ組(1 μM)，嗎啡Ⅲ組(1 mM)，曲馬多Ⅰ組(10 nM)，曲馬多Ⅱ組(10 μM)，曲馬多Ⅲ組(10 mM)。

1.2.2 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡將濃度為5×105個(gè)/mL MADB-106乳腺癌細(xì)胞消化接種到六孔板中，待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別加入相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組;藥物作用24 h后，用0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集、洗滌細(xì)胞，各組分別加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入 5 μL Propidium Iodide，混勻;室溫、避光、反應(yīng)5～15 min;用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)、配制成濃度為5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后洗滌細(xì)胞兩次。用完全培養(yǎng)基稀釋嗎啡和曲馬多至所需濃度，每孔加入200 μL相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;將96孔板進(jìn)行MTT染色，采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(OD值)，λ=490 nm，計(jì)算不同濃度嗎啡和曲馬多對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率及藥物半抑制濃度(IC50)［9］。

抑制率(%)=(陰性對(duì)照組－實(shí)驗(yàn)組)/陰性對(duì)照組×100%。

1.2.4 Western blot法檢測(cè) caspase-3 和 caspase-8表達(dá) 每1×106細(xì)胞加入50 μL細(xì)胞溶解緩沖液，充分裂解細(xì)胞，離心取上清液，按說(shuō)明書(shū)操作，加入各類(lèi)相關(guān)試劑。內(nèi)參為β-Actin(1∶1000)，測(cè)定條帶灰度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)參灰度值的比值反映caspase-3、caspase-8、激活型 caspase-3和激活型caspase-8的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以機(jī)率單位加權(quán)回歸法(Bliss法)計(jì)算IC50。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度嗎啡和曲馬多對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，不同濃度的嗎啡和曲馬多與腫瘤細(xì)胞直接作用24 h后，劑量依賴(lài)性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡(圖1)。由表1可知，等效鎮(zhèn)痛濃度的嗎啡與曲馬多并無(wú)差異(P ＞0.05)。

圖1 流式檢測(cè)不同濃度嗎啡和曲馬多對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響

表1 各組細(xì)胞凋亡率

2.2 不同濃度嗎啡和曲馬多對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響 見(jiàn)表2。結(jié)果顯示嗎啡與曲馬多均濃度依賴(lài)性抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。嗎啡抑制腫瘤細(xì)胞增殖的IC50為11.3 mM，曲馬多抑制腫瘤細(xì)胞增殖的IC50為31.3 mM。

表2 MTT檢測(cè)不同濃度嗎啡和曲馬多對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

2.3 各組caspase-3和caspase-8表達(dá)變化 嗎啡1 mM和曲馬多10 mM分別與腫瘤細(xì)胞作用24 h后各組總的caspase-3和caspase-8蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異，而二者的激活片段則出現(xiàn)了顯著的改變，嗎啡組和曲馬多組caspase-3激活片段表達(dá)均增加(表3，P＜0.05)，但caspase-8激活片段僅嗎啡組表達(dá)增高，曲馬多組無(wú)明顯變化。

表3 各組caspase-3和caspase-8表達(dá)變化(%，±s)

表3 各組caspase-3和caspase-8表達(dá)變化(%，±s)

注:與空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組比較，*P＜0.05

caspase-8空白對(duì)照組組別 激活型caspase-3 激活型0.33 ±0.02 0.24 ±0.02溶劑對(duì)照組 0.36 ±0.02 0.28 ±0.01嗎啡1 mM 0.68 ±0.03* 0.49 ±0.03*曲馬多 10 mM 0.67 ±0.01*0.27 ±0.02

3 討論

腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后和復(fù)發(fā)具有重要意義。本研究體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明嗎啡和曲馬多均可濃度依賴(lài)性抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，這與以前研究［12-15］相一致。但本研究結(jié)果與前研究［13-14］也有所不同，筆者發(fā)現(xiàn)1 nM嗎啡即可促進(jìn)MADB-106乳腺癌細(xì)胞的凋亡，等效鎮(zhèn)痛濃度的曲馬多同樣可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而Tegeder等［10］研究認(rèn)為高濃度的嗎啡(＞10 μM)可顯著抑制MCF-7和MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

盡管進(jìn)行了大量的研究，但嗎啡等阿片類(lèi)藥物調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的具體機(jī)制仍不清楚。阿片受體不僅在外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，在許多正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面同樣存在［1，11］。嗎啡可與細(xì)胞表面阿片受體結(jié)合，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)。其機(jī)制包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)、C-Jun氨基末端激酶的激活，活性氧、NO的產(chǎn)生，促凋亡的Bim表達(dá)增加，抗凋亡的Bcl-2表達(dá)降低以及p53、NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路等［12-15］。曲馬多則具有雙重鎮(zhèn)痛機(jī)制，一方面可與μ受體結(jié)合，另一方面可激活中樞單胺能系統(tǒng)，抑制5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素的攝取。本研究結(jié)果表明曲馬多和嗎啡一樣，同樣可濃度依賴(lài)性抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，并且等效鎮(zhèn)痛濃度的嗎啡與曲馬多并無(wú)差異。既往研究認(rèn)為不僅僅是阿片受體還有其他受體系統(tǒng)參與腫瘤細(xì)胞增殖，如生長(zhǎng)抑素受體、阿片與煙堿和雌激素信號(hào)途徑的相互作用等［16-17］。因此筆者推測(cè)曲馬多調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡的機(jī)制除了與μ受體作用以外，中樞單胺能系統(tǒng)同樣在其中發(fā)揮重要作用。

嗎啡與阿片受體結(jié)合后通過(guò)下游何種信號(hào)途徑最終產(chǎn)生細(xì)胞凋亡尚不清楚。盡管目前對(duì)凋亡過(guò)程的詳細(xì)機(jī)制尚不完全清楚，但是已經(jīng)確定半胱氨酸蛋白酶(caspase)在凋亡過(guò)程中是起著至關(guān)重要作用［18］。目前主要的細(xì)胞凋亡通路均與caspase激活有關(guān)。細(xì)胞凋亡的過(guò)程即是caspase不可逆水解底物的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)過(guò)程。參與誘導(dǎo)凋亡的caspase分成兩大類(lèi):啟動(dòng)酶和效應(yīng)酶，它們分別在凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游和下游發(fā)揮作用。啟動(dòng)caspase包括啟動(dòng)caspase-8，9，10。啟動(dòng) caspase可發(fā)生同源活化，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中最早發(fā)生。啟動(dòng)caspase活化后，即開(kāi)啟細(xì)胞內(nèi)的死亡程序，通過(guò)異源活化方式水解下游caspase將凋亡信號(hào)放大，同時(shí)將死亡信號(hào)向下傳遞。被異源活化的caspase即效應(yīng)caspase，包括caspase-3，6，7。本 研 究 結(jié) 果 表 明 caspase-3 和caspase-8信號(hào)通路參與了嗎啡誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的凋亡。這與既往研究結(jié)果相一致［12］，但本研究結(jié)果表明曲馬多與嗎啡誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制并不完全相同，曲馬多僅增加caspase-3激活片段的表達(dá)，而對(duì)caspase-8激活片段的表達(dá)并無(wú)明顯影響。表明與嗎啡促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程不同，曲馬多可能通過(guò)其他通路最終激活 caspase-3，中間并不通過(guò)caspase-8通路的激活。其具體通路尚有待研究。

總之，嗎啡和曲馬多均可濃度依賴(lài)性促進(jìn)MADB-106乳腺癌細(xì)胞的凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。嗎啡和曲馬多誘導(dǎo)MADB-106乳腺癌細(xì)胞的凋亡均與caspase-3途徑有關(guān)，嗎啡可能通過(guò)激活caspase-8從而激活caspase-3途徑，而曲馬多激活caspase-3途徑與caspase-8激活無(wú)關(guān)。

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