趙曉峰

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院呼吸科，呼和浩特 010050）

痰液小巨噬細胞是一種高度活躍的細胞，該細胞可增加慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者呼吸道內(nèi)炎癥性反應(yīng)［1］。COPD患者痰上清液細胞因子、趨化因子和蛋白酶水平表現(xiàn)為經(jīng)常性增加，其痰液小巨噬細胞可能會帶來上清蛋白和其他細胞特定的趨化因子表達模式。為此，本院研究了COPD患者和LPS刺激后健康者中痰小巨噬細胞趨化因子的表達，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取3組人群，健康對照者8例，男3例，女5例，年齡（32.2±9.4）歲；COPD組11例，男10例，女1例，年齡（66.6±11.1）歲，預(yù)計平均 FEV1值（41±8.3）%；以及吸入20μg LPS的健康招募者4例（以下簡稱LPS組），男2例，女2例，年齡（47.2±20.9）歲，通過肺活量和身體體積描記法測定呼吸系統(tǒng)癥狀和肺功能參數(shù)。3組在性別、年齡方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 痰誘導(dǎo)處理 收集各組誘導(dǎo)痰之前需對LPS組事先作處理，24h之內(nèi)對4例健康者行誘導(dǎo)痰收集與檢查，經(jīng)LPS刺激性吸入24h后再次進行痰液采集，吸入次數(shù)計算以20μg LPS沉積于呼吸道為準。LPS組納入標準為健康者吸入最高劑量乙酰甲膽堿時均表現(xiàn)出微弱的不良反應(yīng)或幾乎無不良反應(yīng)（氣道阻力增加不到2倍）。COPD組和健康對照組患者霧化吸入經(jīng)過滅菌的生理鹽水，COPD患者吸入0.9%～3%，健康對照組吸入0.9%～5%。吸入者要求用力用鼻吹氣，并洗凈嘴巴，對準培養(yǎng)皿方向用力咳嗽。COPD患者和對照組霧化生理鹽水吸入時間不超過15min，對咳痰立即作冷凍處理。為排除其他干擾因素，COPD組、LPS組與健康對照組的咳痰于同一條件統(tǒng)一處理。痰液用4倍量二巰基蘇糖醇（sputolysin）稀釋使溶液均勻，痰液／Sputolysin放置于37℃水浴中維持20min，隨后加入等體積的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）（PH＝7.4）。產(chǎn)生的細胞懸浮液，通過100μm和40μm的細胞篩過濾大分子凝聚物，將細胞800g在4°C下離心10min。收集上清液檢測蛋白，并用臺盼藍染色排除法對粒細胞進行存活力分析。分離細胞前，將細胞顆粒和懸浮分散于PBS（2%FCS）中用流式細胞儀對其染色。

1.2.2 痰巨噬細胞的分離 為了獲得高純度的痰巨噬細胞，下一步分離將采用RosetteSep細胞分離法。將細胞懸液3mL、濾除紅細胞的單核細胞和50μL富集單核細胞混合，在室溫條件下孵育20 min。細胞用組織培養(yǎng)等級PBS液1∶1稀釋，用超過1∶1的淋巴細胞分離液分層，以800g離心30 min產(chǎn)生一個單核層。將單核細胞層抽濾洗凈，懸浮于游離態(tài)LPS的PBS／2%FCS溶液中。對細胞計數(shù)，用臺盼藍排除染色法檢測細胞存活力。隔離的痰液巨噬細胞再次通過流式細胞儀分析檢查總純度，為接下來的RT－PCR應(yīng)用做準備。

1.3 觀察指標

分離前后分別經(jīng)RosetteSep法對小型和大型痰巨噬細胞分離測定；RT－PCR檢測CCL系列基因和分析小巨噬細胞純度。酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法對單核細胞趨化蛋白（CCL2、CCL7、CC13和CCL22）作定量測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，兩組均數(shù)比較用t檢驗，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組樣本痰液小巨噬細胞的單核細胞趨化蛋白表達

據(jù)報道［2］發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)痰樣本中小巨噬細胞數(shù)目與COPD患者呼吸道中都檢測到明顯水平升高。而本研究中小巨噬細胞在8例健康對照組中的比例為4.9%，而11例COPD患者中小巨噬細胞比例達到80.6%。COPD組和LPS組小巨噬細胞水平明顯高于對照組（P＜0.01），LPS未吸入前小巨噬細胞水平也明顯低于吸入LPS后（P＜0.05）（見表1）。

表1 各組樣本痰中小巨噬細胞水平（±s）

表1 各組樣本痰中小巨噬細胞水平（±s）

與對照組比較，＊＊P＜0.01；與LPS組刺激后比較，＃P＜0.05

組別 n 小巨噬細胞／%COPD組 11 85.6± 8.2＊＊對照組 8 12.6± 7.1 LPS組LPS刺激前 4 18.2± 9.2＃LPS刺激后 4 63.6±25.6＊＊

2.2 巨噬細胞中單核細胞趨化蛋白CCL系列表達

本研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比較，COPD患者中CCL2、CCL7、CCL13和CCL22的mRNA明顯高水平表達。COPD組患者CCL2水平約是對照組的16倍，CCL7水平約為對照組的13倍，CCL2為對照組的12倍。與對照組相比，COPD痰液小巨噬細胞中CCL表達水平增長最多的是CCL13，其水平增加了100多倍。LPS誘導(dǎo)痰液小巨噬細胞趨化因子表達模式中，CCL2、CCL7向上調(diào)節(jié)，而CCL13向下調(diào)節(jié)（見表2）。

表2 各組痰液巨噬細胞中單核細胞趨化蛋白CCL系列表達水平（倍）（±s）

表2 各組痰液巨噬細胞中單核細胞趨化蛋白CCL系列表達水平（倍）（±s）

與對照組相比，＊＊P＜0.01

組別 n CCL2 CCL7 CCL13 CCL22 COPD組 11 16.2±20.9＊＊ 13.0±8.2＊＊ 110.0±225.0＊＊12.3±15.5＊＊LPS刺激組 4 6.5± 4.5＊＊3.3±1.1＊＊0.3± 0.1＊＊ 0.9± 0.4對照組8 1.0± 0.0 1.0±0.0 1.0± 0.0 1.0± 0.0

3 討論

痰液分析是一種通過非侵入分析法了解炎癥呼吸道疾病的過程［3，4］。關(guān)注于細胞游離痰上清液，以及細胞因子、趨化因子、蛋白酶水平增加的報道有很多，以COPD呼吸道炎癥為例，患者中性粒細胞水平往往驟然增加［5］。在COPD患者與囊性纖維化患者中可以看到，患者體內(nèi)大巨噬細胞往往會轉(zhuǎn)變成小巨噬細胞，這些細胞雖然對LPS受體（CD14）基因和抗組織相容性抗原－DR有持續(xù)高水平表達，但也下調(diào)了巨噬細胞表面清道夫受體的表達，降低了細胞吞噬功能［6］。

通過對炎癥疾病的研究［7］發(fā)現(xiàn)：誘導(dǎo)痰樣本的炎癥患者中小巨噬細胞百分比顯然高于健康對照組。小巨噬細胞是COPD患者經(jīng)LPS刺激誘導(dǎo)的呼吸道炎癥模型中一類重要的細胞。本研究對純化痰小巨噬細胞的基因表達做研究并集中討論趨化因子，趨化因子可以引起其他白細胞比如中性粒細胞（CXC－趨化因子）、淋巴細胞和單核細胞（CC－趨化因子）定向移動。

趨化因子可以分成兩大類，即CXC趨化因子和CC趨化因子，它們的受體分別稱CC受體和CXC受體。對15種趨化因子表達時的研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者中CCL2、CCL7、CCL13和CCL22表達增加，而剩下的11種趨化因子表達未明顯增加。CCL2（單核細胞趨化蛋白－1，MCP－1）通過多種類型細胞產(chǎn)生［8］，其中包括成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞、平滑肌、系膜、星形膠質(zhì)細胞、單核細胞和小膠質(zhì)細胞。CCL7也稱為單核細胞趨化蛋白－3（MCP－3），由多種炎癥細胞因子誘導(dǎo)，而CCL7在COPD中的作用模式還未可知。CCL13也稱為單核細胞趨化蛋白－4（MCP－4），它是一個有力的嗜酸性粒細胞趨化活性的CC趨化因子。Taha等［9］在哮喘患者誘導(dǎo)痰標本中檢測出CCL13表達水平明顯高于對照組。CCL22最初叫 MDC（巨噬細胞源性趨化因子），是由巨噬細胞和樹突狀細胞產(chǎn)生的趨化因子。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的組成部分［10］，LPS通過與Toll樣受體4（TLR－4）結(jié)合并激活 NF－κB信號通路，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，包括各種趨化因子的表達。LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，包括全身反應(yīng)如發(fā)燒、局部血液粒細胞增多、痰液中細胞因子增加和血液白細胞涌入增多。已證明LPS對肺呼吸道入侵會導(dǎo)致大量小巨噬細胞的涌入。與COPD患者痰巨噬細胞趨化因子的表達相比，經(jīng)LPS刺激導(dǎo)致明顯不同的趨化因子表達模式，表明不同誘導(dǎo)環(huán)境會導(dǎo)致痰液小巨噬細胞呈現(xiàn)出不同的特性。

Traves等［11］研究發(fā)現(xiàn)，COPD 患者誘導(dǎo)痰中CCL2蛋白水平明顯增高，而支氣管肺泡灌洗液則無此現(xiàn)象，這與本實驗研究結(jié)果一致。目前對CCL7在COPD患者中的作用不明確，本研究中可見COPD患者痰巨噬細胞中CCL7、CCL2、CCL13和CCL22水平增加數(shù)倍，4種趨化因子水平增加最高的是CCL13，提示CCL13可能具有調(diào)節(jié)各類白細胞的作用。但趨化因子在炎癥性疾病中的作用還值得進一步研究。

LPS組痰液小巨噬細胞明顯增加，這些水平的增加可能是炎癥非特異性反應(yīng)的結(jié)果。雖然本研究中炎癥患者的痰液小巨噬細胞水平均一致性升高，可COPD患者和LPS組患者之間的趨化因子細胞基因表達模式卻不盡相同：COPD組趨化因子水平升高，而LPS組一些趨化因子水平卻有下降，LPS組CCL13的表達水平比對照組小，而COPD組的CCL13水平卻為正常對照組的100多倍。從研究結(jié)果來看，實驗證實了COPD組患者和經(jīng)LPS刺激后的健康者痰液小巨噬細胞水平都有明顯增高；COPD組趨化因子基因表達模式對CCL2、CCL7、CCL13和CCL22都有誘導(dǎo)作用，而經(jīng)LPS刺激后的健康者僅對CCL2、CCL7和CCL22有誘導(dǎo)作用。

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