焦亞莉 楊麗娟 朱蕾 陳蕾 霍亞平

實體腫瘤的生長侵襲與轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的生成。對腫瘤血管生成機制的研究，目前主要集中于VEGF家族和具有調(diào)節(jié)血管生成作用的酪氨酸激酶受體[1]。所有促血管生成因子中，VEGF在血管生成過程中起著關(guān)鍵性作用。本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測大腸癌組織及癌旁組織中VEGF、Ki-67的表達，并探討VEGF表達與CD34計數(shù)的微血管密度（MVD）的關(guān)系，從而評價VEGF在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。同時觀察Ki-67在腫瘤及瘤旁組織中的表達及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集安陽市第六人民醫(yī)院和安陽市第二人民醫(yī)院2009-2011年資料完整的60例大腸癌根治術(shù)標本，患者術(shù)前均未經(jīng)過任何抗腫瘤治療。其中男42例，女18例，中位年齡52歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者33例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者27例。大腸癌按WHO（2005）分型及有/無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進行分組。另選取大腸癌癌旁組織20例作為對照組。

1.2 研究方法 全部標本經(jīng)4%中性甲醛液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，HE染色。免疫組化采用SP法。鼠抗人單克隆抗體VEGF、鼠抗人單克隆抗體CD34、鼠抗人單克隆抗體Ki-67及免疫組化試劑盒均購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。以同一條件下染色的陽性片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判定 VEGF、CD34定位于細胞質(zhì)，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。陽性細胞數(shù)>10%為（+）。CD34陽性的單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇被視為血管。先低倍鏡下全面觀察切片以選擇腫瘤內(nèi)4個血管著色最密集的區(qū)域，在200倍鏡下用網(wǎng)格狀目鏡測微尺計數(shù)染成棕色的血管數(shù)目，取4個視野的均值作為MVD值。Ki-67以腫瘤細胞核出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽性，陽性細胞數(shù)1%～20%為（+），21%～50%為（++），>50%為（+++）。

1.4 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用 字2檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 VEGF在癌組織中的陽性表達率為76.7%（46/60），明顯高于癌旁組織中的35.0%（7/20），兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。VEGF在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性表達率也不同，分別為87.9%（29/33）和63.0%（17/27），兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在癌組織中，VEGF陽性細胞彌漫并多聚集成團。從整體看，癌旁腸組織中VEGF陽性反應(yīng)強度和范圍較癌組織明顯減弱。VEGF表達與癌細胞的胞質(zhì)呈彌漫顆粒狀，見圖1。

圖1 瘤組織中VEGF陽性表達（免疫組化SP法×200）

2.2 Ki-67與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Ki-67在大腸癌組織中的陽性表達率為73.2%明顯高于癌旁腸組織的20.1%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Ki-67陽性表達與有/無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P>0.05）。Ki-67表達與癌細胞的胞核見圖2。

圖2 瘤組織中Ki-67陽性表達（免疫組化SP法×200）

2.3 VEGF陽性與MVD的相關(guān)性 46例大腸癌VEGF陽性表達組的MVD值為（38.32±12.65），14例VEGF陰性表達組為（29.63±9.3），兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。CD34定位于血管內(nèi)皮細胞質(zhì)，見圖3。

圖3 微血管CD34陽性表達（免疫組化SP法×200）

3 討論

腫瘤新生血管的生成過程中，VEGF被認為是最重要的促發(fā)因子，并與創(chuàng)傷愈合等生理性的新生血管形成有關(guān)。研究表明，VEGF具有促進內(nèi)皮細胞分裂增殖，誘導毛細血管生芽、增加微血管通透性、促進內(nèi)皮細胞遷移和抑制凋亡等多種作用[2]。VEGF-A可與VEGFR-1及VEGFR-2結(jié)合，但主要通過與VEGF-2結(jié)合發(fā)揮促血管生成作用[3]，缺氧引起細胞缺氧誘導因子1α和2α過表達，繼而活化VEGF基因轉(zhuǎn)錄。同時突變的K-ras等癌基因、腫瘤抑制基因、一些生長因子及細胞因子等誘導VEGF的表達與分泌。本組研究顯示，VEGF在大腸癌中的表達顯著高于相應(yīng)癌旁組織的表達（P<0.01）；VEGF陽性表達在有/無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌中有顯著差異（P<0.05），提示VEGF在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。在肺癌患者組織和血漿中亦被證明VEGF表達水平顯著升高[4-5]，且分期越晚血漿VEGF水平升高越明顯。急性白血病患者血液中的VEGF含量明顯升高，初始發(fā)病者較緩解組升高有統(tǒng)計學意義[6]，證明VEGF含量與病情的臨床變化有關(guān)，對了解病情、判斷預后有幫助。

腫瘤的生長過程有兩個顯著階段，即從無血管的血管前期緩慢生長階段轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒艿难芷诳焖僭鲋畴A段。隨著腫瘤性血管的增生腫瘤加速生長，血管為腫瘤生長提供營養(yǎng)。實驗證明，腫瘤在無血管時呈線性生長，在血管生長時呈指數(shù)生長[7]。目前，MVD檢測方法已成為定量分析腫瘤血管生成的金指標。MVD是一個獨立而重要的預后因素，高MVD提示腫瘤易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預后不良[8]。血管亦為腫瘤轉(zhuǎn)移提供重要的途徑，有血道遠處轉(zhuǎn)移的患者預后往往較差。多數(shù)研究表明，VEGF的表達水平與MVD相關(guān)[9]，本組研究中VEGF陽性表達組MVD值顯著高于VEGF陰性組（P<0.05），提示VEGF在大腸癌中可誘導微血管形成。

增殖能力的活躍程度是惡性腫瘤的重要標志之一，判斷腫瘤的增殖能力是鑒別腫瘤的良惡性、提示腫瘤預后的重要指標。相較于高倍鏡下進行核分裂計數(shù)，穩(wěn)定的腫瘤增殖標記分子在免疫組化中的應(yīng)用被認為是判斷腫瘤增殖能力的可靠技術(shù)。Ki-67為細胞增生指數(shù)，是目前公認的穩(wěn)定的腫瘤增殖標記分子[10-11]。本組研究中，Ki-67在大腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織（P<0.05），提示Ki-67可用于大腸癌的診斷和腫瘤發(fā)生的研究。

綜上所述，大腸癌組織中VEGF、Ki-67的表達明顯高于癌旁腸組織，且VEGF的表達與有/無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和MVD相關(guān)，表明VEGF在腫瘤血管形成、腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。VEGF及其受體是抗血管生成靶向治療的主要靶標，VEGF檢測對以VEGF為作用靶點的抗血管生成治療具有明顯的指導意義。

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