陳紹椿 尹躍平 戴秀芹 孫厚華 于瑞星 韓燕 陳祥生

·論著·

淋球菌對頭孢曲松的敏感性及淋球菌多抗原測序分型研究

陳紹椿 尹躍平 戴秀芹 孫厚華 于瑞星 韓燕 陳祥生

目的探討南京市淋球菌對頭孢曲松的敏感性以及相應菌株的淋球菌多抗原測序分型(NGMAST)基因型別。方法2007年和2012年在中國疾病預防控制中心性病控制中心臨床防治基地分別收集了204株和81株淋球菌,經過分離純化及鑒定后,用瓊脂稀釋法測定其對頭孢曲松的最小抑菌濃度(MIC);菌株培養(yǎng)后利用試劑盒提取DNA,并進行淋球菌多抗原測序分型(NG-MAST)。結果測試的285株淋球菌MIC≥ 0.060 μg/ml的菌株比例為63.2%,MIC≥ 0.125 μg/ml的比例為31.6%。2012年MIC≥ 0.060 μg/ml和MIC≥ 0.125 μg/ml的菌株比例分別為44.4%和11.1%,2007年MIC≥ 0.060 μg/ml和MIC≥ 0.125 μg/ml的菌株比例分別為70.6%和39.7%。NG-MAST分型研究顯示,285株淋球菌共有166個型別,菌株多樣性較高,其中73種為已知型別,93種為新型別。2007年測定的所有菌株中以ST568(n=13),ST270(n=9),ST421(n=7),ST2288(n=5),ST1731(n=4),ST1766(n=4),ST1866(n=4),ST1870(n=4)等為主。2012年測定的所有菌株中以ST2318(n=5),ST1053(n=4),ST5990(n=4),ST8726(n=4)為主。相同NG-MAST型別的菌株具有相同或相近的MIC值。 結論 2012年與2007年菌株的優(yōu)勢型別有較大變化,某些型別與頭孢藥敏值有較強對應關系。NG-MAST分型可能作為分子生物學標記用于淋球菌耐藥監(jiān)測。

奈瑟球菌,淋病;抗藥性;頭孢曲松

淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)感染引起的淋病是常見性傳播疾病之一,該病可通過抗生素治愈,現(xiàn)在推薦使用頭孢曲松治療,由于抗生素的廣泛應用,淋球菌本身又極易獲取外源耐藥基因,所以淋球菌對各種抗生素的耐藥性不斷增加,對頭孢曲松的敏感性不斷下降[1]。特別令人擔憂的是,近年來,

在日本[2]、法國[3]、西班牙[4]發(fā)現(xiàn)了對頭孢曲松高度耐藥的淋球菌菌株,即“超級淋球菌”,甚至還出現(xiàn)了臨床治療失敗的病例[2-3，5-10]。近20年耐藥監(jiān)測數據顯示,淋球菌對頭孢曲松產生低敏的趨勢非?？?形勢嚴峻。淋球菌基因分型技術是現(xiàn)有追蹤耐藥菌株起源及傳播的有效方法之一,可了解淋球菌在特定時間和特定地域的遺傳和進化。本研究對南京市收集的淋球菌臨床菌株進行頭孢曲松最小抑菌濃度(MIC)的測定,用淋球菌多抗原測序分型技術(NG-MAST)對所有菌株進行分型研究。

材料和方法

一、菌株收集及頭孢曲松MIC的測定

2007年和2012年在中國疾病預防控制中心性病控制中心臨床防治基地分別收集了204株和81株淋球菌,經過分離純化及鑒定后,用瓊脂稀釋法測定對頭孢曲松的MIC[11]。淋球菌基礎培養(yǎng)基成分為每500 ml含18 g GC瓊脂粉(英國Oxoid公司),50 ml無菌脫纖維羊血(南京便診生物科技有限公司),培養(yǎng)基中頭孢曲松[世界衛(wèi)生組織(WHO)提供]濃度范圍為 0.008 μg/ml～ 0.500 μg/ml。 每批試驗用已知MIC值的WHO標準菌株進行質量控制(WHO G、WHO K、WHO L)。菌株完成MIC值測定后-70℃保存于脫脂牛奶管中。

二、DNA提取

菌株統(tǒng)一用淋球菌基礎培養(yǎng)基復蘇后,刮取平板上菌落于200 μl磷酸緩沖液中混懸均勻,用比濁儀調整菌懸液濃度至0.5麥氏單位。菌體DNA使用德國Qiagen公司生產的QIAxtractor全自動核酸純化儀提取DNA,所用試劑為儀器配套的QIAxtractor DX Kits。實驗操作按照儀器說明書及提取液體樣本的試驗方案進行,方案如下：向200 μl菌懸液中加入120 μl DXL緩沖液,45℃振蕩加熱處理1 h。待樣本冷卻至室溫,1 000×g離心10 min。轉移300 μl上清至2000 μl樣本板中,進行全自動核酸純化。

三、NG-MAST分型

用Martin等文獻報道的方法[12],簡述如下：PCR擴增porB基因和tbpB基因,擴增產物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,在正確位置有條帶的產物送至北京華大基因公司進行純化測序。porB基因測序結果與基因庫中已知序列(基因庫號M21289)進行比對,以M21289序列為參考,截取從第455位堿基開始的490 bp大小的基因片段進入NG-MAST網站比對以獲取porB基因的等位基因型別;tbpB基因測序結果與基因庫中已知序列(U65222)進行比對,以U65222序列為參考,截取從第1118位堿基開始的390 bp大小的基因片段進入NG-MAST網站比對以獲取tbpB基因的等位基因型別;最后再綜合porB和tbpB基因的等位基因型別從NG-MAST網站獲取該菌株的基因型別。

結 果

一、頭孢曲松MIC值的分布

共檢測285株淋球菌,MIC測定的濃度范圍為 0.008 μg/ml～ 0.500 μg/ml, 有 1株菌 MIC 值為 0.500 μg/ml, 所有菌株中MIC≥ 0.060 μg/ml的菌株比例為 63.2%,MIC≥ 0.125 μg/ml比例為31.6%。兩年收集菌株的MIC值分布見表1。2012年MIC值集中于0.030(38.3%)和0.06(33.3%),MIC≥0.060 μg/ml的菌株比例為 44.4%(36/81),2007年MIC值集中于 0.030(24.0%)、0.060(30.9%)和0.125(32.4%),MIC≥0.060μg/ml的菌株比例為70.6%(144/204);2007年和 2012年 MIC ≥ 0.125 μg/ml的比例分別為39.7%(81/204)和11.1%(9/81),χ2檢驗顯示兩年MIC≥ 0.125 μg/ml的比例,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=21.94,P＜0.01),見圖1。

二、NG-MAST型別分布

285株淋球菌共分出166個型別,菌株多樣性較高,其中73種為已知型別,93種為新型別。2007年共分出123個型別,其中54種為已知型別,69種為新型別,其中ST568(n=13),ST270(n=9),ST421(n=7),ST2288(n=5),ST1731(n=4),ST1766(n=4),ST1866(n=4),ST1870(n=4)為優(yōu)勢型別;2012年共分出52個型別,其中27種為已知型別,25種為新型別,其中ST2318(n=5),ST1053(n=4),ST5990(n=4),ST8726(n=4)為優(yōu)勢型別。

表1 2007年和2012年臨床分離的淋球菌菌株對頭孢曲松的MIC值分布(株)

圖1 2007年和2012年臨床分離淋球菌菌株對頭孢曲松在不同MIC值下的分布比例

表2 2007年和2012年特定優(yōu)勢型別對應的頭孢曲松MIC值分布(例)

三、不同NG-MAST型別菌株頭孢曲松MIC值的分布

從表2中,可發(fā)現(xiàn)相同NG-MAST型別的菌株具有相同或相近的MIC值,一般跨度不超過3個濃度級。如 ST568,主要集中于 0.030 μg/ml和 0.060 μg/ml兩個濃度,ST270集中于 0.125 μg/ml濃度,而ST1766全部為0.060 μg/ml一個濃度,這些ST型別與頭孢曲松MIC值有較強的對應關系。

討 論

我們一直對中國不同地區(qū)淋球菌耐藥趨勢進行監(jiān)測,根據文獻報道,MIC≥ 0.060 μg/ml的淋球菌可以認為是敏感性下降的菌株[13],結合已有的監(jiān)測數據顯示,1989—1990年MIC≥ 0.060 μg/ml的菌株比例為27.60%(21/76)[14],1999年為17.86%,到了2001年上升到50.00%[13],而我們的研究顯示,2007年MIC≥0.060 μg/ml菌株的比例為70.60%,2012年MIC≥ 0.060 μg/ml菌株比例為44.40%。從20世紀90年代至今,MIC≥ 0.060 μg/ml菌株的比例有較大變化,近年來更是保持較高比例。2007年有1株型別為ST2288的菌株,MIC為0.500 μg/ml,是否為耐藥菌株還需要進一步確定,國際上現(xiàn)有報道的耐藥菌株也沒有此型別。兩年MIC≥0.125 μg/ml的比例差異有統(tǒng)計學意義,2007年比2012年高,可能與兩年收集菌株的構成差異較大有關,我們的分子分型數據也顯示兩年菌株的型別差異較大。我們的研究發(fā)現(xiàn)某些ST型別與頭孢曲松MIC值有較強的對應關系,如ST568,ST270,ST1766,屬于這些型別的大部分菌株頭孢曲松MIC值集中于特定范圍內。這樣的對應關系對于追蹤特殊菌株(如耐藥菌株)的傳播有著重要意義,我們可以在某一特定區(qū)域內建立菌株型別數據庫,一旦出現(xiàn)特殊菌株,通過和本地區(qū)數據庫進行比對,從而對其溯源。另外,在特定區(qū)域內,利用頭孢曲松MIC和ST型別之間的對應關系,直接在臨床開展分子分型研究,從而快速判別其頭孢曲松MIC值的大致范圍是非常有意義的,但這需要建立起較為龐大的數據庫,以提高其準確性。

在本研究的NG-MAST分型實驗中,分離出166個型別,說明南京市淋球菌的多樣性,而且其中有93種新型別,可能與NG-MAST數據庫中缺少中國地區(qū)相關數據有關,為此,我們將所有新型別上傳至NG-MAST數據庫,以豐富該數據庫中中國地區(qū)淋球菌型別的數據。2007—2012年菌株之間優(yōu)勢型別的差異表明,2007—2012年間南京市的淋球菌型別構成有很大的變化,說明了時間上的跨度較大,該地區(qū)性網絡發(fā)生了波動。

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2013-04-25)

(本文編輯：吳曉初)

Ceftriaxone susceptibility testing and multi-antigen sequence typing ofNeisseria gonorrhoeaestrains isolated in 2007 and 2012 from Nanjing,China

Chen Shaochun，Yin Yueping，Dai Xiuqin，Sun Houhua，Yu Ruixing，

Han Yan，Chen Xiangsheng.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College;National Center for Sexually Transmitted Disease Control，China Center for Disease Control and Prevention，Nanjing 210042，China

Yin Yueping，Email:yinyp@ncstdlc.org

ObjectiveTo test the ceftriaxone susceptibility ofNeisseria gonorrhoeae(NG)isolates from Nanjing city，and to assess their genotypes by using the NG multi-antigen sequence typing(NG-MAST)method.MethodsA total of 204 NG strains isolated in 2007 and 81 in 2012 from Nanjing city were included in this study.The minimum inhibitory concentration(MIC)of ceftriaxone was determined for these strains using an agar dilution method.DNA was extracted by the Qiagen commercial kit from these strains followed by NG-MAST.Results All the isolates were susceptible to ceftriaxone(MIC，≤ 0.25 μg/ml).The MIC of ceftriaxone was ≥ 0.06 μg/ml for 63.2%of all the NG strains，70.6%of those isolated in 2007 and 44.4%of those in 2012，and ≥ 0.125 μg/ml for 31.6%of all the NG strains，39.7%of those isolated in 2007，11.1%of those in 2012.Totally，166 genotypes were identified among the 285 isolates，of which，73 had been reported，and 93 were previously unreported.The most prevalent genotype was ST568(n=13)in NG strains isolated in 2007，followed by ST270(n=9)，ST421(n=7)，ST2288(n=5)，ST1731(n=4)，ST1766(n=4)，ST1866(n=4)，ST1870(n=4)，while ST2318(n=5)，ST1053(n=4)，ST5990(n=4)，ST8726(n=4)were the common genotypes in 2012.Those isolates with identical or similar genotypes tended to display similar MICs for ceftriaxone.ConclusionsThe prevalent genotypes of NG are markedly different between 2007 and 2012 in Nanjing region，and there is a strong association between the genotypes and ceftriaxone susceptibility of NG.NG-MAST results may serve as a genetic marker in the surveillance of antibiotic susceptibility in NG.

Neisseria gonorrhoeae;Drug resistance;Ceftriaxone

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.05.003

國家自然科學基金青年科學基金(81101294);協(xié)和青年基金(3332013143)

210042南京,中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病研究所、中國疾病預防控制中心性病控制中心

尹躍平,Email：yinyp@ncstdlc.org