牟韻竹 張正中 楊浩

黑斑息肉綜合征一家系致病基因的新突變

牟韻竹 張正中 楊浩

目的對黑斑息肉綜合征一家系的STK-11基因突變進行檢測。方法PCR擴增此家系的患者和健康人的STK-11基因的全部外顯子,并測序?qū)ふ抑虏⊥蛔?選取100例健康人作為對照。結果該家系患者STK-11基因外顯子9的第1251位發(fā)生G/T雜合突變。家系中健康對照個體和健康對照中均未發(fā)現(xiàn)相應突變。結論錯義突變A417S可能影響基因轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物,是STK-11基因新的特異性突變。

Peutz-Jeghers綜合征;基因,STK-11;突變

黑斑息肉綜合征又稱Peutz-Jeghers綜合征(PJS)。該病是以皮膚黏膜色素沉著伴胃腸道多發(fā)息肉為特征的常染色體顯性遺傳病,息肉組織病理特征屬于錯構瘤?；蜻B鎖分析將PJS致病基因定位于染色體19P13.3,研究表明,其上的SK11基因((絲氨酸/蘇氨酸激酶)的異常是PJS的主要致病原因[1-2]。本文報道四川漢族PJS一家系,并通過PCR和DNA直接測序法對該家系進行SK11基因的突變檢測。

一、對象和方法

(一)病歷資料:PJS家系來自于四川省,共調(diào)查3代10人,患病2人。研究對象為先證者及其母親2人。先證者,男,19歲,口唇起黑點15年,腹痛1個月余就診。15年前患者口唇部出現(xiàn)針尖至米粒大小的棕色至黑色斑點,無疼痛及瘙癢感,未引起重視,皮損逐漸增多,近年來無明顯變化。3年前患者出現(xiàn)腹痛,便血,入住我院普外科。皮膚科檢查:皮損位于口唇黏膜,可見散在或密集的棕色斑及黑斑(圖1);胃腸鏡檢查結果示:胃多發(fā)性息肉、結腸多發(fā)性息肉(圖2);組織病理診斷為腺瘤樣息肉,符合黑斑息肉綜合征。手術切除后好轉(zhuǎn)出院。1年前隨訪,患者死于結腸癌。先證者父親有口唇黏膜黑斑病史,39歲死于胃癌。母親未見發(fā)病,父母非近親結婚。

(二)方法:

圖1 先證者口唇黏膜可見散在或密集的棕色斑點及黑斑

圖2 胃腸鏡結果 2a:胃多發(fā)性息肉;2b:多發(fā)性結腸息肉

1.基因組DNA提取:在征得患者及其家屬知情同意后,經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,采集先證者及其母親外周靜脈血5 ml置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中抗凝,采用鹽析法提取基因組DNA,并同時提取100例無親屬關系健康人的基因組DNA(已簽署知情同意書)作為對照,以排除可能存在的基因多態(tài)性。

2.引物設計采用Primer 5.0引物設計軟件設計,根據(jù)SK11基因的10對外顯子序列設計引物并進行PCR擴增,其中9號外顯子序列為F:5′-TTGTCAGCTTGCCTCCTACTC-3′;R:5′-GGAATGCACCCACTCTGAGA-3′;Fi:5′-TGAGGTT CCTGCAGTCAGTAC-3′,Ri:5′-GGTCACCATGACTGACTAGC G-3′擴增出1 416 bp產(chǎn)物。

3.PCR擴增:反應體系為50 μl,10×緩沖液 5 μl, primer(20 mmol/L)1.0 μl×2,dNTP(10 mmol/L)1.0 μl,MgCl2(25 mmol/L)5 μl,Taq酶0.5 μl,模板DNA 1.0 μl,ddH2O 35.5 μl擴增條件:95℃預變性3 min;94℃變性30 s,55～60℃退火30 s,72℃延伸40～60 s,共25個循環(huán);72℃后修復延伸5～8 min。將擴增產(chǎn)物純化后送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

二、結果

該家系中先證者檢測出SK11基因9號外顯子第1251位堿基發(fā)生G-T錯位,即417位密碼子由GCC變?yōu)門CC,丙氨酸變成了絲氨酸(圖3)。其母親和無親緣關系的100例健康對照均未發(fā)現(xiàn)此突變位點,說明此突變是該家系的一個致病突變而非單核苷酸多態(tài)性。

圖3 SK11基因測序結果 3a:在患者第9外顯子第1251位發(fā)生G/T錯義突變,使417位密碼子由GCC變成TCC;3b:正常對照

三、討論

PJS發(fā)病率約為1/20萬,其發(fā)病與STK11基因密切相關。STK11基因又名LKB1基因,是一種腫瘤抑制基因,對細胞能量代謝、細胞的增殖與分化有重要的關系[3]。另有研究表明,LKB1基因突變影響P53的活性,其可能在P53誘導的細胞凋亡中也發(fā)揮著作用[4-5],其抑癌的具體分子機制尚未完全明確。PJS的腫瘤發(fā)病率比一般人高出9～18倍[6]。研究表明,在PJS患者中有50%～90%發(fā)現(xiàn)有STK11基因突變[7-8]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的STK11基因突變有145種胚系突變和40種體系突變,突變方式主要包括基因的雜合缺失,移碼突變、無義突變、錯義突變,插入突變等。STK11基因突變可導致其編碼的一種絲氨酸/蘇氨酸激酶失活,其表達水平的降低可導致體細胞其他腫瘤相關基因突變的累積,最終致惡性腫瘤的發(fā)生。本例患者最終死于結腸癌也說明了此錯義突變可能干擾STK11/LKB1的功能，,影響基因轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物,使細胞增殖失控,從而發(fā)生癌變。

本研究發(fā)現(xiàn),患者STK11基因9號外顯子第1251位堿基發(fā)生G-T錯位,即417位密碼子由GCC變?yōu)門CC,丙氨酸變成了絲氨酸。而家系中其母親和無親緣關系的100例健康對照均未發(fā)現(xiàn)此突變位點,證實此突變是該家系的致病突變而不是單核苷酸多態(tài)性,表明此錯義突變A417S是導致患者發(fā)病的一種新的突變[9]。

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2013-10-10)

(本文編輯:吳曉初)

A novel mutation in the STK-11 gene in a pedigree with Peutz-Jeghers syndrome

Mu Yunzhu，Zhang Zhengzhong，Yang Hao.Department of Dermatology，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China.

Zhang Zhengzhong，Email:laowaiaeo@163.com

ObjectiveTo detect mutations in the STK-11 gene in a pedigree with Peutz-Jeghers syndrome (PJS).MethodsBlood samples were collected from a 19-year-old male patient with PJS and his unaffected mother，as well as from 100 unrelated healthy human controls.PCR was performed to amplify all the exons of the STK-11 gene followed by sequencing.ResultsA novel heterozygous missense mutation(G-to-T transition)was identified at position 1251 in the exon 9 of the STK-11 gene in the patient，but not in his mother or the unrelated healthy human controls.ConclusionsThe missense mutation A417S，which may affect gene transcription and translation，is a specific novel mutation of STK-11 gene.

Peutz-Jeghers syndrome;Genes，STK-11;Mutation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.021

四川省教育廳自然科學基金(09ZC047)

637000四川南充,川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院皮膚科

張正中,Email:laowaiaeo@163.com