王輝 趙學(xué)良

氨基酮戊酸光動(dòng)力療法治療尖銳濕疣對(duì)病灶乳頭瘤病毒復(fù)制的影響

王輝 趙學(xué)良

目的檢測(cè)氨基酮戊酸光動(dòng)力方法(ALA-PDT)治療前后,尖銳濕疣患者病灶局部人乳頭瘤病毒(HPV)6/11型DNA載量的變化。方法選擇電離子去除疣體后HPV6/11陽(yáng)性患者分為兩組,光動(dòng)力組32例采用ALA-PDT治療,對(duì)照組29例不治療。3個(gè)月后用熒光定量PCR檢測(cè)病灶局部HPV6/11型DNA載量。結(jié)果3個(gè)月后光動(dòng)力組29例中有26例HPV DNA陰轉(zhuǎn)(89.7%),對(duì)照組19例中有13例HPV DNA陰轉(zhuǎn)(68.4%);光動(dòng)力組HPV DNA載量為(1.70×105±7.86×105)拷貝/ml,對(duì)照組HPVDNA載量為(1.27×106± 2.21×106)拷貝/ml,兩組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論ALA-PDT能降低尖銳濕疣患者病灶局部HPV病毒載量。

尖銳濕疣;光化學(xué)療法;人乳頭狀瘤病毒

氨基酮戊酸光動(dòng)力療法(ALA-PDT)治療尖銳濕疣,具有療效好、安全性高、復(fù)發(fā)率低等優(yōu)勢(shì),但其治療的機(jī)制需進(jìn)一步研究。90%的尖銳濕疣是由人乳頭瘤病毒(HPV)HPV6/11亞型感染引起[1]。本研究通過(guò)ALA-PDT治療尖銳濕疣前后檢測(cè)尖銳濕疣患者病灶局部HPV6/11亞型DNA載量變化,觀察ALA-PDT對(duì)HPV DNA復(fù)制的影響,探討ALA-PDT治療尖銳濕疣的機(jī)制。

一、對(duì)象與方法

1.對(duì)象:2011年6月至2013年9月來(lái)本院皮膚性病科門(mén)診就診患者,根據(jù)文獻(xiàn)[2]確診為尖銳濕疣,有典型的皮損,醋酸白試驗(yàn)陽(yáng)性。排除標(biāo)準(zhǔn):自身免疫性疾病、惡性腫瘤、嚴(yán)重內(nèi)科疾病、肝腎功能異常、6個(gè)月內(nèi)曾使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)藥物、感染及合并其他性傳播疾病、妊娠或哺乳婦女、血液系統(tǒng)疾病。皮損部位:男性位于冠狀溝、龜頭、包皮內(nèi)外板、系帶、陰莖、陰囊、肛周等處;女性位于大小陰唇、處女膜殘端、陰道口、肛周等處。疣體直徑0.5～1.6 cm,數(shù)目2～16個(gè)。96例患者均在局麻下采用GX-Ⅲ型多功能電離子手術(shù)治療機(jī)(購(gòu)于廣西科學(xué)院應(yīng)用物理研究所)電灼去除疣體,治療后創(chuàng)面外用紅霉素軟膏,治療后7～10 d復(fù)診時(shí)取皮損局部脫落細(xì)胞檢測(cè)HPV6/11載量,陽(yáng)性病例(HPV載量＞103 IU/ml)61例作為研究對(duì)象。將61例分為2組,光動(dòng)力組32例,男19例,女13例,平均27.8歲(17～46歲);對(duì)照組29例,男17例,女12例,平均29.1歲(18～45歲),兩組患者性別、年齡、HPV載量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),受試者均簽署知情同意書(shū)。

2.治療方法:光動(dòng)力組:鹽酸氨基酮戊酸散(上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司提供)配制成20%鹽酸氨基酮戊酸溶液均勻敷于原疣體部位及其周?chē)? cm內(nèi)的正常皮膚,用保鮮膜封包后再以紗布覆蓋,膠帶固定,局部避光3 h后,用XD-635AB型光動(dòng)力(PDT)激光治療儀(購(gòu)于桂林市興達(dá)光電醫(yī)療器械有限公司)進(jìn)行治療。設(shè)定治療參數(shù):波長(zhǎng)635 nm,照射時(shí)間20 min,光纖頭與皮損呈垂直方向,兩者之間的距離為10～15 cm,能量密度l00 J/cm2。照射中疼痛明顯者適當(dāng)調(diào)節(jié)輸出功率,但不低于150 mW,同時(shí)延長(zhǎng)照光時(shí)間。每7～10天治療1次,共2次。對(duì)復(fù)發(fā)的病例增加治療次數(shù),最多治療4次。對(duì)照組:電離子手術(shù)去除疣體后不再進(jìn)行治療,在隨訪過(guò)程中出現(xiàn)復(fù)發(fā)病例則進(jìn)行電離子手術(shù)去除疣體或外用咪喹莫特去除疣體。兩組復(fù)發(fā)病例不再進(jìn)入HPV載量檢測(cè)的統(tǒng)計(jì)。兩組患者初次治療后連續(xù)隨訪3個(gè)月,第1個(gè)月每7～10天隨訪1次,以后每月隨訪1次,連續(xù)觀察3個(gè)月。治療3個(gè)月后取原病灶表面脫落細(xì)胞做HPV DNA檢測(cè)。

3.標(biāo)本采集:分別于電離子手術(shù)治療去除疣體后7～10 d和治療后3個(gè)月采集61例CA患者病灶局部表皮脫落細(xì)胞HPV DNA載量檢測(cè)。為確保采樣的標(biāo)準(zhǔn)化,固定1名護(hù)士負(fù)責(zé)采樣,用生理氯化鈉溶液浸潤(rùn)過(guò)的無(wú)菌棉拭子來(lái)回擦拭原病灶部位3次,將棉拭子浸入備有1 ml無(wú)菌生理氯化鈉溶液的無(wú)菌試管中,充分漂洗后棄棉拭子,扣緊試管蓋,做好標(biāo)記,放置-20℃冰箱保存。

4.試劑與儀器:試劑為中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供人乳頭瘤病毒(6,11型)核酸定量檢測(cè)試劑盒(PCR熒光法)。LightCycler 480熒光定量PCR擴(kuò)增儀購(gòu)于瑞士羅氏公司。生物安全柜購(gòu)于上海瑞仰凈化裝備公司。Legend Micro 21高速離心機(jī)為美國(guó)Sorvall公司生產(chǎn)。

5.檢測(cè)方法:取出待測(cè)樣本全部轉(zhuǎn)至1.5 ml離心管中, 13 874×g離心5 min,去上清液,沉淀加滅菌生理氯化鈉溶液1 ml混勻,13 874×g離心5 min,去上清液,沉淀加入50 μl DNA提取液后,煮沸制備DNA模板,置入配置好的PCR反應(yīng)管,放入PCR擴(kuò)增儀。擴(kuò)增參數(shù)為93℃預(yù)變性2 min,93℃45 s,55℃60 s擴(kuò)增10個(gè)循環(huán),然后按93℃30 s,55℃45 s, 30個(gè)循環(huán)。通過(guò)配套軟件分析數(shù)據(jù),直接給出樣本定量結(jié)果,每次實(shí)驗(yàn)均做陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn);復(fù)發(fā)率和HPV DNA陰轉(zhuǎn)率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.療效:光動(dòng)力組32例在治療后3個(gè)月內(nèi)29例治愈(90.6%),3個(gè)月內(nèi)無(wú)復(fù)發(fā),另3例復(fù)發(fā)1次。對(duì)照組29例在治療后3個(gè)月內(nèi)19例治愈(65.5%),10例復(fù)發(fā)(34.5%),其中4例復(fù)發(fā)1次,4例復(fù)發(fā)2次,2例復(fù)發(fā)3次。兩組治愈率和復(fù)發(fā)率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。

2.病灶局部HPV6/11型DNA載量檢測(cè)情況:剔除復(fù)發(fā)病例最終48例進(jìn)入病毒載量檢測(cè)統(tǒng)計(jì);光動(dòng)力組29例,對(duì)照組19例。在電離子手術(shù)去除疣體后7～10 d兩組病例病灶局部病毒HPV載量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3個(gè)月后兩組病例病毒HPV載量均有大幅下降,光動(dòng)力組26例陰性(HPV載量＜103);對(duì)照組13例陰性,但下降幅度低于光動(dòng)力組。見(jiàn)表1。

表1 光動(dòng)力組與對(duì)照組病灶局部HPV6/11型DNA載量變化

三、討論

尖銳濕疣用傳統(tǒng)治療方法容易復(fù)發(fā),復(fù)發(fā)的確切機(jī)制尚不清楚,但病原體的數(shù)量即病毒載量和毒力是一個(gè)很重要的因素。蔣藝等[3]檢測(cè)62例尖銳濕疣患者治療前后HPV6/11載量,治療后的病毒載量較治療前下降或陰性,治療后仍陽(yáng)性者復(fù)發(fā)率高于檢測(cè)陰性者,認(rèn)為病毒載量與尖銳濕疣患者復(fù)發(fā)密切相關(guān)。ALA-PDT治療尖銳濕疣,具有療效好、安全性高、復(fù)發(fā)率低等優(yōu)勢(shì)[4-5]。本研究以病灶局部HPV6/11型載量作為觀察指標(biāo)。光動(dòng)力組病例3個(gè)月治愈率90.6%,復(fù)發(fā)率僅為9.4%顯著低于單純電離子除疣組(對(duì)照組)。光動(dòng)力組29例中有26例HPV DNA檢測(cè)呈陰性,陰轉(zhuǎn)率為89.7%;對(duì)照組19例有13例HPVDNA檢測(cè)陰轉(zhuǎn),陰轉(zhuǎn)率為68.4%,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能與兩組樣本少有關(guān)。治療前兩組病毒載量無(wú)明顯差異(P＞0.05),ALA-PDT治療后光動(dòng)力組病毒載量為(1.7×105±7.86×105)拷貝/ml,顯著低于對(duì)照組的(1.27×106±2.21×106)拷貝/ml(P＜0.05)?？梢?jiàn)ALAPDT能夠有效地降低CA患者病灶局部HPV病毒載量,消除局部HPV感染,防止CA復(fù)發(fā)。病灶局部HPV病毒載量降低的機(jī)制可能與ALA-PDT治療后感染病毒的細(xì)胞凋亡、壞死和脫落有關(guān)[6],其確切機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

[1]Stanley MA.Genital human papillomavirus infections:current and prospective therapies[J].J Gen Virol，2012，93:681-691.

[2]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.尖銳濕疣診療規(guī)范(試行).2000-8-7.

[3]蔣藝，吳洋，陳嵐華，等.尖銳濕疣患者治療前后人乳頭瘤病毒核酸的熒光定量分析[J].中華皮膚科雜志，2007，40(5):307-308.

[4]Wang XL，Wang HW，Wang HS，et al.Topical 5-aminolaevulinic acid-photodynamic therapy for the treatment of urethral condylomata acuminata[J].Br J Dermatol，2004，151(4):880-885.

[5]涂平，鄭和義，顧恒，等.外用鹽酸氨基酮戊酸光動(dòng)力療法治療尖銳濕疣多中心隨機(jī)對(duì)照研究[J].中華皮膚科雜志，2007，40(2):67-70.

[6]張?jiān)品?，繆飛，王宏偉，等.氨基酮戊酸光動(dòng)力治療尖銳濕疣局部免疫反應(yīng)的研究[J].中華皮膚科雜志，2013，46(5):309-312.

2014-01-15)

(本文編輯:吳曉初)

Inhibitory effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on human papillomavirus replication in condyloma acuminatum lesions

Wang Hui，Zhao Xueliang.Department of Dermatology，Weifang People′s Hospital，Weifang 261041，Shandong，China

Zhao Xueliang，Email:zhxl5801@163.com

ObjectiveTo detect the changes in DNA loads of human papillomavirus(HPV)type 6/11 in lesions of patients with condyloma accuminatum(CA)before and after 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy (ALA-PDT).MethodsAfter removal of warts by electrocautery，HPV6/11-positive patients with CA were divided into two groups:treatment group(32 cases)receiving two sessions of ALA-PDT with intervals of 7-10 days，and control group(29 cases)remaining untreated.Exfoliated cells were collected from the lesional sites of these patients before and 3 months after the first session of ALA-PDT，and fluorescence-based quantitative PCR was conducted to estimate the DNA loads of HPV 6/11 in these cells.Results Three months after the first session of ALA-PDT，89.7%(26/29)of the patients in the treatment group and 68.4%(13/19)in the control group became HPV DNA negative，with significant differences between the treatment group and control group in the DNA loads of HPV ((1.70±7.86)×105vs.(1.27±2.21)×106copies/ml，P＜0.05).Conclusion ALA-PDT can reduce HPV DNA loads in lesions of CA in patients.

Condylomata acuminata;Photochemotherapy;Human papillomavirus

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.019

濰坊市科技發(fā)展計(jì)劃(201302029)

261041山東,濰坊市人民醫(yī)院皮膚科

趙學(xué)良,Email:zhxl5801@163.com