陳秀杰 李艷玲 曲芃芃△

宮頸癌在全球女性最常見的癌癥中居第二位。據(jù)統(tǒng)計，宮頸癌每年的新發(fā)病例約52.98萬，死亡病例約25.51萬，85%發(fā)生在發(fā)展中國家[1]。高危型人乳頭瘤病毒（high risk human papillomavirus,HRHPV）的持續(xù)感染是宮頸癌的主要致病因素，其中HPV16和HPV18是最常見的高危型別，70%～75%的浸潤性宮頸癌與其有關(guān)[2]。HPV作為宮頸癌的主要病因?qū)W因素，型別檢測具有重要的臨床指導(dǎo)意義。目前，雜交捕獲法Ⅱ（hybrid captureⅡ，HCⅡ）在臨床上已經(jīng)得到普及，但不能提供HPV分型。近年來，HPV分型技術(shù)成為國內(nèi)外的研究熱點，本課題前期研究已表明，應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)檢測HRHPV感染結(jié)果與HCⅡ有很好的一致性[3]。本研究采用巢式PCR和焦磷酸測序技術(shù)對459例健康查體者進(jìn)行HPV檢測及基因型分析，旨在研究特定人群HPV感染情況、型別分布及其高危因素，為HPV疫苗的應(yīng)用及宮頸癌的早期篩查提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年10—12月在我院進(jìn)行宮頸HPV感染篩查的459例無癥狀醫(yī)務(wù)工作者為研究對象，年齡26～60歲，平均（41.1±7.7）歲，均長期居住于本市，收集其一般資料、月經(jīng)婚育史、生殖道疾病既往史等。

1.2 主要試劑與儀器 微量樣品基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技公司；內(nèi)參β-globin引物、MY09/11與GP5+/6+均由上海生工生物有限公司合成；PCR Master Mix（dNTPS，MgCl2和Taq DNA聚合酶預(yù)混試劑）購自Fermentas公司；梯度PCR儀（ABI，美國）；GEL 200凝膠成像系統(tǒng)（柯達(dá)，美國）；焦磷酸測序儀（PyroMarkQ96 ID）及試劑盒均購自QIAGEN公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集與處理 先將陰道或?qū)m頸口多余的分泌物用棉簽輕輕擦去，再用一次性宮頸細(xì)胞采集器緊貼于宮頸口，輕輕轉(zhuǎn)動3～5圈，收集宮頸脫落細(xì)胞，置于專用的細(xì)胞保存緩沖液中，新柏氏液基薄層細(xì)胞制片進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查，殘余細(xì)胞標(biāo)本4℃保存。

1.3.2 HPV檢測和分型 （1）HPV DNA片段的巢式PCR擴(kuò)增。嚴(yán)格按照試劑盒說明書提取宮頸脫落細(xì)胞DNA，以βglobin基因作為內(nèi)參檢測DNA提取質(zhì)量。使用HPV通用引物MY09/11和GP5+/6+進(jìn)行擴(kuò)增，其序列見表1。首先以標(biāo)本DNA為模板用MY09/11引物擴(kuò)增，其次將擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板用GP5+/6+引物進(jìn)行巢式擴(kuò)增。每次PCR都設(shè)立陽性對照和陰性對照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，凝膠成像分析儀成像，150 bp處出現(xiàn)陽性條帶者為HPV陽性標(biāo)本。HPV陽性標(biāo)本的巢式擴(kuò)增產(chǎn)物用于分型。（2）焦磷酸測序分型。12種高危型HPV的特異引物序列及單鏈測序模板的制備參考Gharizadeh等[4]研究報道，引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成，每4種引物混合為1組，分3組。單鏈模板制備完成后釋放到含測序引物的緩沖液中，80℃變性2 min，室溫冷卻。按照PyroMarkQ96 ID儀器操作說明，設(shè)定SQA程序，在試劑倉中加入足量的dATP、dTTP、dCTP、dGTP及酶和底物，將反應(yīng)板放入檢測倉進(jìn)行檢測。根據(jù)測序結(jié)果，與已知的12種高危型HPV序列[4]比較，讀出HPV感染標(biāo)本的基因型別。

Table 1 Sequences of HPV general primers MY09/11,GP5+/6+and sizes of the PCR-amplified fragments表1 HPV DNA擴(kuò)增通用引物MY09/11、GP5+/6+序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間HPV感染率的比較采用χ2檢驗，多因素分析采用Logistic回歸，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV的感染率及亞型分布 459例中有82例樣本檢測出HPV陽性，檢出率為17.9%。共檢測出7種HR-HPV類型，各亞型分布及檢出率見表2。9例HPV陽性標(biāo)本未能檢測出基因型別。HPV16的檢出率最高為9.8%，其次為HPV58（7.0%）、HPV18（5.2%）。在HPV基因分型的結(jié)果中，存在單純感染、雙重感染和多重感染，最多為4種型別的HPV混合感染（HPV16、18、58、59），各種感染模式的檢出率見表3，HPV混合感染中雙重感染的檢出率最高，占陽性標(biāo)本的26.8%。

Table 2 Distribution and prevalence of HPV genotypes in 82 HPV-positive samples表2 82例HPV陽性標(biāo)本的基因型別分布及各型別檢出率

Table 3 Patterns and prevalence of HPV infection表3 HPV感染模式及檢出率 （n=82）

2.2 HPV感染的年齡分布 HPV感染平均年齡為（38.2±6.2）歲，以10歲為1個年齡段分組，26～35歲、36～45歲、46～60歲各年齡組的HPV感染率見表4，其中35～45年齡組HPV感染率最高為27.1%，高于其他2組（P＜0.05）。

Table 4 The age distribution of HPV infection表4 HPV感染的年齡分布 例（%）

2.3 HPV感染的相關(guān)危險因素單因素分析 飲酒、經(jīng)濟(jì)收入低、性伴侶＞1個、性生活頻率＞4次/月、伴有宮頸糜爛、宮頸炎癥者HPV感染的比例較高（P＜0.05或P＜0.01），見表5。

2.4 HPV感染相關(guān)危險因素分析 以HPV感染為因變量，將表5中有意義的因素引入多因素非條件Logistic回歸分析，結(jié)果示飲酒、經(jīng)濟(jì)收入＜3 000元/月、性伴侶＞1個、性生活頻率＞4次/月、伴有宮頸糜爛是HPV感染的危險因素，見表6。

Table 5 The univariate analysis of risk factors for HPV infection表5 HPV感染的相關(guān)危險因素單因素分析 例（%）

3 討論

HPV根據(jù)其致病性分為高危型和低危型，低危型主要引起生殖器官尖銳濕疣，高危型HPV持續(xù)感染可導(dǎo)致女性外陰、陰道、宮頸損害，甚至癌變。HPV感染是宮頸癌的主要致病因素，99%的子宮頸癌都與生殖器官感染高危型HPV有關(guān)[5]。不同HPV亞型致癌的危險性大小不同，因此，對HPV感染篩查及型別檢測是現(xiàn)階段預(yù)防和控制子宮頸癌的重要手段。在不同國家與地區(qū)，HPV的人群感染率不同，在我國北京、山西、新疆等地區(qū)，HPV檢出率為10%～40%不等[6-8]。HPV16、58、18、52和33型是我國子宮頸癌患者中最常見的5種HPV型別[9]?，F(xiàn)階段存在多種HPV分型技術(shù)，HCⅡ法在臨床已經(jīng)得到普及，但不能對HPV進(jìn)行具體分型。焦磷酸測序技術(shù)是近年來發(fā)明的一種新型DNA測序技術(shù)，是目前基因分型最可靠的手段。研究證實焦磷酸測序技術(shù)檢測HR-HPV感染結(jié)果與HCⅡ有很好的一致性[4]。本研究采用巢式PCR和焦磷酸測序技術(shù)對459宮頸細(xì)胞學(xué)樣本進(jìn)行HPV DNA檢測和分型，結(jié)果表明，HPV感染率為17.9%（82/459），高于中國婦女HPV感染率16.8%[9]，這也許與地域、經(jīng)濟(jì)文化、工作環(huán)境和工作性質(zhì)等多方面因素有關(guān)。9例陽性標(biāo)本未檢出基因型別，可能是由于MY09/11通用引物只針對30多種型別的HPV，而目前的測序引物限制在12種高危型別的HPV，即對其他的高危型別和低危型別可能存在漏檢。73例陽性標(biāo)本成功分型，共有7種高危型別被檢出，未檢測出HPV31、35、39、51、56，HPV各亞型感染率由高到低依次為HPV16、58、18、45、33、59、52，HPV16仍然是最常見的亞型，并且常伴有其他型別混合感染。趙方輝等[9]報道HPV18、52是正常婦女中最常見的第2位和第3位HPV型別，但本研究結(jié)果顯示HPV58、18為最常見的第2、3位HPV型別，沒有檢測出HPV52，可見HPV亞型分布存在地域和人群差異。

Table 6 The Logistic regression analysis of risk factors for HPV infection表6 HPV感染的相關(guān)危險因素Logistic回歸分析結(jié)果

陳玲等[10]認(rèn)為HPV多重感染易導(dǎo)致宮頸癌變，一定程度上對宮頸病變及宮頸癌的發(fā)生發(fā)展起到了促進(jìn)作用，HPV多重感染檢測可預(yù)測宮頸癌的發(fā)生風(fēng)險。本研究結(jié)果顯示，HPV雙重、三重、四重檢出率分別為4.8%、1.3%、0.2%，其中雙重感染最常見，占混合感染的75.9%，HPV58在混合感染中占有較大優(yōu)勢比例，應(yīng)該引起足夠的重視。

HPV的感染率與年齡密切相關(guān)。許多研究報道婦女生殖道HPV感染的高峰年齡是18～28歲，感染率可達(dá)25%～30%[11]。本調(diào)查是針對特殊人群，研究對象為26～60歲醫(yī)務(wù)工作者，不包括26歲以下婦女。本研究的3個年齡組中，35～40歲組感染率最高，達(dá)到27.1%，且高于其他2組。5%～10%的HPV感染在35歲后可轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)感染狀態(tài)[12]，HPV持續(xù)感染是癌變發(fā)生的一個必不可少的因素，應(yīng)對該年齡階段的婦女進(jìn)一步采取干預(yù)和防治措施。

國內(nèi)外大量研究報道，吸煙、性伴侶數(shù)、初次性交年齡、分娩次數(shù)等危險因素與HPV感染相關(guān)[13-15]。本研究顯示，飲酒、經(jīng)濟(jì)收入＜3 000元/月、性伴侶＞1個、性生活頻率＞4次/月、伴有宮頸糜爛是HPV感染的危險因素。由此提示，應(yīng)對廣大婦女加強(qiáng)健康宣傳，尤其應(yīng)該重視高危人群的防癌普查，以降低HPV感染率和宮頸癌發(fā)病率。

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