陳秀杰 李艷玲 曲芃芃△
宮頸癌在全球女性最常見的癌癥中居第二位。據(jù)統(tǒng)計,宮頸癌每年的新發(fā)病例約52.98萬,死亡病例約25.51萬,85%發(fā)生在發(fā)展中國家[1]。高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus,HRHPV)的持續(xù)感染是宮頸癌的主要致病因素,其中HPV16和HPV18是最常見的高危型別,70%~75%的浸潤性宮頸癌與其有關(guān)[2]。HPV作為宮頸癌的主要病因?qū)W因素,型別檢測具有重要的臨床指導(dǎo)意義。目前,雜交捕獲法Ⅱ(hybrid captureⅡ,HCⅡ)在臨床上已經(jīng)得到普及,但不能提供HPV分型。近年來,HPV分型技術(shù)成為國內(nèi)外的研究熱點,本課題前期研究已表明,應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)檢測HRHPV感染結(jié)果與HCⅡ有很好的一致性[3]。本研究采用巢式PCR和焦磷酸測序技術(shù)對459例健康查體者進(jìn)行HPV檢測及基因型分析,旨在研究特定人群HPV感染情況、型別分布及其高危因素,為HPV疫苗的應(yīng)用及宮頸癌的早期篩查提供依據(jù)。
1.1 一般資料 選取2010年10—12月在我院進(jìn)行宮頸HPV感染篩查的459例無癥狀醫(yī)務(wù)工作者為研究對象,年齡26~60歲,平均(41.1±7.7)歲,均長期居住于本市,收集其一般資料、月經(jīng)婚育史、生殖道疾病既往史等。
1.2 主要試劑與儀器 微量樣品基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技公司;內(nèi)參β-globin引物、MY09/11與GP5+/6+均由上海生工生物有限公司合成;PCR Master Mix(dNTPS,MgCl2和Taq DNA聚合酶預(yù)混試劑)購自Fermentas公司;梯度PCR儀(ABI,美國);GEL 200凝膠成像系統(tǒng)(柯達(dá),美國);焦磷酸測序儀(PyroMarkQ96 ID)及試劑盒均購自QIAGEN公司。
1.3 方法
1.3.1 標(biāo)本采集與處理 先將陰道或?qū)m頸口多余的分泌物用棉簽輕輕擦去,再用一次性宮頸細(xì)胞采集器緊貼于宮頸口,輕輕轉(zhuǎn)動3~5圈,收集宮頸脫落細(xì)胞,置于專用的細(xì)胞保存緩沖液中,新柏氏液基薄層細(xì)胞制片進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查,殘余細(xì)胞標(biāo)本4℃保存。
1.3.2 HPV檢測和分型 (1)HPV DNA片段的巢式PCR擴(kuò)增。嚴(yán)格按照試劑盒說明書提取宮頸脫落細(xì)胞DNA,以βglobin基因作為內(nèi)參檢測DNA提取質(zhì)量。使用HPV通用引物MY09/11和GP5+/6+進(jìn)行擴(kuò)增,其序列見表1。首先以標(biāo)本DNA為模板用MY09/11引物擴(kuò)增,其次將擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板用GP5+/6+引物進(jìn)行巢式擴(kuò)增。每次PCR都設(shè)立陽性對照和陰性對照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,溴乙錠染色,凝膠成像分析儀成像,150 bp處出現(xiàn)陽性條帶者為HPV陽性標(biāo)本。HPV陽性標(biāo)本的巢式擴(kuò)增產(chǎn)物用于分型。(2)焦磷酸測序分型。12種高危型HPV的特異引物序列及單鏈測序模板的制備參考Gharizadeh等[4]研究報道,引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成,每4種引物混合為1組,分3組。單鏈模板制備完成后釋放到含測序引物的緩沖液中,80℃變性2 min,室溫冷卻。按照PyroMarkQ96 ID儀器操作說明,設(shè)定SQA程序,在試劑倉中加入足量的dATP、dTTP、dCTP、dGTP及酶和底物,將反應(yīng)板放入檢測倉進(jìn)行檢測。根據(jù)測序結(jié)果,與已知的12種高危型HPV序列[4]比較,讀出HPV感染標(biāo)本的基因型別。
Table 1 Sequences of HPV general primers MY09/11,GP5+/6+and sizes of the PCR-amplified fragments表1 HPV DNA擴(kuò)增通用引物MY09/11、GP5+/6+序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度
1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,組間HPV感染率的比較采用χ2檢驗,多因素分析采用Logistic回歸,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 HPV的感染率及亞型分布 459例中有82例樣本檢測出HPV陽性,檢出率為17.9%。共檢測出7種HR-HPV類型,各亞型分布及檢出率見表2。9例HPV陽性標(biāo)本未能檢測出基因型別。HPV16的檢出率最高為9.8%,其次為HPV58(7.0%)、HPV18(5.2%)。在HPV基因分型的結(jié)果中,存在單純感染、雙重感染和多重感染,最多為4種型別的HPV混合感染(HPV16、18、58、59),各種感染模式的檢出率見表3,HPV混合感染中雙重感染的檢出率最高,占陽性標(biāo)本的26.8%。
Table 2 Distribution and prevalence of HPV genotypes in 82 HPV-positive samples表2 82例HPV陽性標(biāo)本的基因型別分布及各型別檢出率
Table 3 Patterns and prevalence of HPV infection表3 HPV感染模式及檢出率 (n=82)
2.2 HPV感染的年齡分布 HPV感染平均年齡為(38.2±6.2)歲,以10歲為1個年齡段分組,26~35歲、36~45歲、46~60歲各年齡組的HPV感染率見表4,其中35~45年齡組HPV感染率最高為27.1%,高于其他2組(P<0.05)。
Table 4 The age distribution of HPV infection表4 HPV感染的年齡分布 例(%)
2.3 HPV感染的相關(guān)危險因素單因素分析 飲酒、經(jīng)濟(jì)收入低、性伴侶>1個、性生活頻率>4次/月、伴有宮頸糜爛、宮頸炎癥者HPV感染的比例較高(P<0.05或P<0.01),見表5。
2.4 HPV感染相關(guān)危險因素分析 以HPV感染為因變量,將表5中有意義的因素引入多因素非條件Logistic回歸分析,結(jié)果示飲酒、經(jīng)濟(jì)收入<3 000元/月、性伴侶>1個、性生活頻率>4次/月、伴有宮頸糜爛是HPV感染的危險因素,見表6。
Table 5 The univariate analysis of risk factors for HPV infection表5 HPV感染的相關(guān)危險因素單因素分析 例(%)
HPV根據(jù)其致病性分為高危型和低危型,低危型主要引起生殖器官尖銳濕疣,高危型HPV持續(xù)感染可導(dǎo)致女性外陰、陰道、宮頸損害,甚至癌變。HPV感染是宮頸癌的主要致病因素,99%的子宮頸癌都與生殖器官感染高危型HPV有關(guān)[5]。不同HPV亞型致癌的危險性大小不同,因此,對HPV感染篩查及型別檢測是現(xiàn)階段預(yù)防和控制子宮頸癌的重要手段。在不同國家與地區(qū),HPV的人群感染率不同,在我國北京、山西、新疆等地區(qū),HPV檢出率為10%~40%不等[6-8]。HPV16、58、18、52和33型是我國子宮頸癌患者中最常見的5種HPV型別[9]?,F(xiàn)階段存在多種HPV分型技術(shù),HCⅡ法在臨床已經(jīng)得到普及,但不能對HPV進(jìn)行具體分型。焦磷酸測序技術(shù)是近年來發(fā)明的一種新型DNA測序技術(shù),是目前基因分型最可靠的手段。研究證實焦磷酸測序技術(shù)檢測HR-HPV感染結(jié)果與HCⅡ有很好的一致性[4]。本研究采用巢式PCR和焦磷酸測序技術(shù)對459宮頸細(xì)胞學(xué)樣本進(jìn)行HPV DNA檢測和分型,結(jié)果表明,HPV感染率為17.9%(82/459),高于中國婦女HPV感染率16.8%[9],這也許與地域、經(jīng)濟(jì)文化、工作環(huán)境和工作性質(zhì)等多方面因素有關(guān)。9例陽性標(biāo)本未檢出基因型別,可能是由于MY09/11通用引物只針對30多種型別的HPV,而目前的測序引物限制在12種高危型別的HPV,即對其他的高危型別和低危型別可能存在漏檢。73例陽性標(biāo)本成功分型,共有7種高危型別被檢出,未檢測出HPV31、35、39、51、56,HPV各亞型感染率由高到低依次為HPV16、58、18、45、33、59、52,HPV16仍然是最常見的亞型,并且常伴有其他型別混合感染。趙方輝等[9]報道HPV18、52是正常婦女中最常見的第2位和第3位HPV型別,但本研究結(jié)果顯示HPV58、18為最常見的第2、3位HPV型別,沒有檢測出HPV52,可見HPV亞型分布存在地域和人群差異。
Table 6 The Logistic regression analysis of risk factors for HPV infection表6 HPV感染的相關(guān)危險因素Logistic回歸分析結(jié)果
陳玲等[10]認(rèn)為HPV多重感染易導(dǎo)致宮頸癌變,一定程度上對宮頸病變及宮頸癌的發(fā)生發(fā)展起到了促進(jìn)作用,HPV多重感染檢測可預(yù)測宮頸癌的發(fā)生風(fēng)險。本研究結(jié)果顯示,HPV雙重、三重、四重檢出率分別為4.8%、1.3%、0.2%,其中雙重感染最常見,占混合感染的75.9%,HPV58在混合感染中占有較大優(yōu)勢比例,應(yīng)該引起足夠的重視。
HPV的感染率與年齡密切相關(guān)。許多研究報道婦女生殖道HPV感染的高峰年齡是18~28歲,感染率可達(dá)25%~30%[11]。本調(diào)查是針對特殊人群,研究對象為26~60歲醫(yī)務(wù)工作者,不包括26歲以下婦女。本研究的3個年齡組中,35~40歲組感染率最高,達(dá)到27.1%,且高于其他2組。5%~10%的HPV感染在35歲后可轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)感染狀態(tài)[12],HPV持續(xù)感染是癌變發(fā)生的一個必不可少的因素,應(yīng)對該年齡階段的婦女進(jìn)一步采取干預(yù)和防治措施。
國內(nèi)外大量研究報道,吸煙、性伴侶數(shù)、初次性交年齡、分娩次數(shù)等危險因素與HPV感染相關(guān)[13-15]。本研究顯示,飲酒、經(jīng)濟(jì)收入<3 000元/月、性伴侶>1個、性生活頻率>4次/月、伴有宮頸糜爛是HPV感染的危險因素。由此提示,應(yīng)對廣大婦女加強(qiáng)健康宣傳,尤其應(yīng)該重視高危人群的防癌普查,以降低HPV感染率和宮頸癌發(fā)病率。
[1]Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.
[2]de Sanjose S,Quint WG,Alemany L,et al.Human papillomavirus genotype attribution in invasive cervical cancer:a retrospective cross-sectional worldwide study[J].Lancet Oncol,2010,11(11):1048-1056.
[3]胡元晶,曲芃芃.焦磷酸測序技術(shù)行子宮頸脫落細(xì)胞高危型HPV分型檢測的意義[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2013,48(3):211-213.
[4]Gharizadeh B,Zheng B,Akhras M,et al.Sentinel-base DNA geno?typing using multiple sequencing primers for high-risk human pap?illomaviruses[J].Mol Cell Probes,2006,20(3):230-238.
[5]王玉豐,林玲,劉春雨,等.三亞地區(qū)婦女人乳頭瘤病毒感染的分子流行病學(xué)調(diào)查[J].檢驗醫(yī)學(xué),2012,27(8):628-630.
[6]李曉陽,郭學(xué)青.北京石景山地區(qū)人乳頭瘤病毒(HPV)感染的分子流行病學(xué)研究[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2011,32(8):866-868.
[7]Zou L,Bao YP,Li N,et al.Life-style and Genital Human Papillo?mavirus in a Cross-Sectional Survey in Shanxi Province,China[J].Asian Pac J Cancer Prev,2011,12(3):781-786.
[8]Chen Z,Meng W,Du R,et al.Genotype distribution and the relative risk factors for human papillomavirus in Urumqi,China[J].Exp Ther Med,2013,6(1):85-90.
[9]趙方輝,喬友林.人乳頭瘤病毒感染分子流行病學(xué)研究[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志,2010,(5):327-331.
[10]陳玲,趙銀玲,耿曉星.HPV感染種系型別與宮頸癌變的相關(guān)性研究[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2011,16(10):874-877.
[11]楊丹球,陳鳳坤,唐惠英,等.廣西沿海地區(qū)婦女宮頸癌患者人乳頭瘤病毒(HPV)感染各亞型分布特點[J].中國婦產(chǎn)科臨床雜志,2011,12(1):14-16.
[12]Bosch FX,Manos MM,Mu?oz N,et al.Prevalence of human papillo?mavirus in cervical cancer:a worldwide perspective[J].J Natl Can?cer Inst,1995,87(11):796-802.
[13]馬會清,魏曉強(qiáng),唐猛.508例女性人乳頭瘤病毒感染及相關(guān)因素分析[J].中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志(電子版),2012,8(4):436-438.
[14]Zhang R,Shi TY,Ren Y,et al.Risk factors for human papillomavi?rus infection in Shanghai suburbs:A population-based study with 10,000 women[J].J Clin Virol,2013,58(1):144-148.
[15]Confortini M,Carozzi F,Zappa M,et al.Human papillomavirus in?fection and risk factors in a cohort of Tuscan women aged 18-24:re?sults at recruitment[J].BMC Infect Dis,2010,10(1):157.