于 飛 王 倩 鐘殿勝 寧 超 馬 晴 肖 平

目前診斷肺癌的方法除影像學、病理學等手段外，各種腫瘤標志物的測定也具有重要價值。血清中癌胚抗原（CEA）、細胞角蛋白片段19、神經(jīng)元特異性烯醇化酶等標志物已被廣泛應(yīng)用于臨床中，但這些標志物敏感性不高，往往在腫瘤負荷較重時才顯著升高。因此，積極尋找敏感度和特異度較高的腫瘤標志物成為目前提高肺癌確診率亟待解決的問題。人附睪蛋白4（HE4）屬于乳清酸性4-二硫化中心（WFDC）蛋白家族。研究報道HE4在多種正常組織（包括呼吸道、生殖道）的上皮內(nèi)均有表達[1]，在卵巢癌組織中過表達[2]，可作為卵巢癌有診斷意義的血清標志物[3]。此外，有學者發(fā)現(xiàn)部分肺癌細胞中HE4可呈陽性表達，并且在部分肺癌患者的血清及組織中也存在HE4高水平表達[4]，這些均提示血清HE4可能是對肺癌有診斷意義的腫瘤標志物。目前，國內(nèi)尚鮮見HE4與肺癌之間關(guān)系的報道，本研究通過檢測HE4在血清中的表達情況，研究其對肺癌診斷及進展評估的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2012年6月—2013年3月于我院呼吸科、腫瘤科及肺外科住院確診為肺癌的患者47例為肺癌組，其中男26例，女21例，年齡43～86歲，平均（65.15±11.08）歲；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）2009年制定的第7版國際TNM分期標準分期，47例患者中Ⅰ～Ⅲ期17例，Ⅳ期30例。納入標準：經(jīng)氣管鏡組織活檢、組織刷片、開胸肺活檢、胸水液基細胞學及沉淀物病理檢查見腫瘤細胞，結(jié)合免疫組化染色及影像學檢查確診為肺癌的患者，且均未接受任何放、化療治療。同時收集2012年7月—2012年12月于我院體檢中心經(jīng)常規(guī)查體、化驗及影像學等檢查結(jié)果無異常的健康體檢者31例為健康組，其中男18例，女13例，年齡44～86歲，平均（61.32±9.60）歲。2組人群年齡（t=1.572）、性別（χ2=0.057）差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

1.2 儀器及試劑 HE4測定試劑盒購自瑞士富吉瑞必歐Fu?jirebio股份有限公司，儀器為瑞典康乃格全自動酶標儀。CEA測定試劑盒購自雅培公司，儀器為美國雅培i2000全自動微粒子化學發(fā)光免疫分析儀。

1.3 方法

1.3.1 標本收集 所有患者于清晨空腹抽取肘正中靜脈血3 mL于普通血清管內(nèi)，立即送實驗室于4℃條件下3 000 r/min離心10 min，取上清液置于1.5 mL離心管內(nèi)，-40℃儲存。

1.3.2 檢測方法 采用酶免疫計量測定法（Enzyme immuno?metric assay，EIA）檢測患者血清中HE4水平；采用化學發(fā)光微粒子免疫測定（Chemiluminescent Microparticle Immunoas?say，CMIA）技術(shù)測定患者血清中CEA水平。具體操作嚴格按照說明書執(zhí)行。

1.4 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布計量資料采用±ss表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；繪制血清HE4及血清CEA診斷肺癌的ROC曲線并計算曲線下面積、敏感度和特異度。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組與健康組血清中HE4水平比較 肺癌患者血清中HE4濃度（253.47±170.03）pmol/L，較健康體檢者血清中HE4濃度（84.09±51.03）pmol/L顯著升高（t=5.365，Plt;0.01）。

2.2 不同病理類型肺癌患者血清中HE4水平比較 根據(jù)各型肺癌的分化程度、形態(tài)特征和生物學特點將47例肺癌患者進行組織病理學分類，分為非小細胞癌組與小細胞癌組。非小細胞癌組33例，男19例，女14例，年齡50～86歲，平均（65.03±8.87）歲。小細胞癌組10例，男5例，女5例，年齡43～80歲，平均（60.20±13.99）歲。另有4例患者病理類型不明確，故未予進行統(tǒng)計分析。2組患者年齡（t=1.031），性別（χ2=0.004）差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。非小細胞癌組進一步分組，鱗癌組7例，男5例，女2例，年齡50～78歲，平均（64.57±8.40）歲；腺癌組26例，男14例，女12例，年齡52～86歲，平均（65.15±9.15）歲。鱗癌組、腺癌組與小細胞癌組3組間患者年齡（F=0.846）、性別（χ2=0.900）差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。非小細胞癌組與小細胞癌組患者血清中HE4濃度分別為（241.34±161.81）pmol/L和（293.5±198.76）pmol/L，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.847，Pgt;0.05）。鱗癌組患者血清中HE4濃度為（304.29±287.61）pmol/L，腺癌組為（224.39±122.15）pmol/L，與小細胞癌組間HE4濃度差異無統(tǒng)計學意義（F=0.969，P＞0.05）。

2.3 Ⅰ～Ⅲ期與Ⅳ期肺癌患者血清中HE4水平比較 47例患者中Ⅰ～Ⅲ期17例，男7例，女10例，年齡50～80歲，平均（61.24±9.64）歲；Ⅳ期30例，男19例，女11例，年齡43～86歲，平均（67.37±11.38）歲。2組患者年齡（t=1.871）、性別（χ2=2.155）差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。Ⅰ～Ⅲ期肺癌患者血清中HE4濃度[（255.27±183.04）pmol/L]與Ⅳ期患者血清中HE4濃度[（288.16±216.49）pmol/L]相比差異無統(tǒng)計學意義（t=0.528，Pgt;0.05）。

2.4 血清HE4和CEA診斷肺癌的ROC分析 以病理結(jié)果為金標準，繪制血清HE4和CEA診斷肺癌的ROC曲線。血清HE4的ROC曲線下面積為0.902（P＜0.001），當血清中HE4濃度為149.145 pmol/L時，其診斷的敏感度和特異度分別為72.3%和90.3%。血清CEA的曲線下面積為0.765（P＜0.001），當CEA質(zhì)量濃度為4.685 μg/L時，敏感度和特異度分別為57.4%和83.9%。圖1顯示血清HE4診斷肺癌的敏感度和特異度均較血清CEA高。

Figure 1 The ROC curve of serum HE4 and serum CEA in diagnosis of lung cancer圖1 血清HE4和CEA診斷肺癌的ROC曲線

3 討論

3.1 HE4的結(jié)構(gòu)及作用 HE4基因最早由Kirchhoff等[5]報道，并于人附睪上皮細胞中克隆出其cDNA，該基因定位于人類基因組染色體20q12-13.1[6]，編碼一段長度為13 ku的蛋白，糖基化形成后約為20～25 ku。HE4屬于乳酸蛋白（whey acidic protien，WAP）結(jié)構(gòu)域家族中的一員，具有疑似胰蛋白酶抑制劑的特性以及抗菌活性和抗炎效果[7]。

3.2 HE4在肺癌患者中的表達及意義 目前國外已有一些關(guān)于HE4與肺癌之間關(guān)系的報道。Bingle等[8]發(fā)現(xiàn)部分肺癌細胞系可表達HE4；Tokuishi等[4]在肺癌細胞胞漿中發(fā)現(xiàn)了免疫熒光染色著色的HE4蛋白。Yamashita等[9]利用免疫測定技術(shù)分別對原發(fā)性肺腺癌及健康志愿者血清中HE4濃度進行檢測，結(jié)果表明肺癌患者血清中HE4濃度明顯較健康組升高，且提示血清中HE4高表達與術(shù)后較高的復發(fā)率有關(guān)。Iwahori等[10]通過酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法對49例肺癌及18例卵巢癌患者血清中HE4濃度進行測定，結(jié)果顯示2組患者血清中HE4水平均較健康組明顯升高；通過敏感性特異性分析，當臨界值定為262.4 pmol/L（6.56 μg/L=262.4 pmol/L）時，90%的非小細胞肺癌、88.9%的小細胞肺癌及44.4%的卵巢癌患者血清中HE4濃度升高；此外對其中24例化療后患者生存率與HE4濃度關(guān)系進行研究發(fā)現(xiàn)，血清中高濃度的HE4與治療后較差的生存率有關(guān)。Yamashita等[11]通過免疫組化法對137例肺腺癌患者組織中HE4蛋白表達情況進行測定，發(fā)現(xiàn)41.6%的患者HE4呈陽性表達，且HE4陽性表達者的5年無病生存率及5年總體生存率均較對應(yīng)的陰性表達者明顯降低。因此，HE4對于肺癌的診斷、預后的評估等可能有較為廣闊的應(yīng)用前景。目前國內(nèi)尚鮮見HE4與肺癌之間關(guān)系的報道，其在血清中的表達情況與肺癌診斷及進展的關(guān)系仍需進一步探究。

3.3 小結(jié) 本研究表明，HE4在肺癌患者血清中的表達高于健康體檢者，但不同病理類型患者血清中HE4濃度無明顯差異，提示血清HE4可能對肺癌的病理類型無明確指向性。Ⅰ～Ⅲ期與Ⅳ期肺癌患者血清中HE4濃度亦無明顯差異，推測HE4的來源可能僅與腫瘤組織局部分泌增加和負荷加重有關(guān)，而與腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移過程無關(guān)。此外，因血清CEA作為肺癌診斷的標志物已廣泛用于臨床，故以此為對照標志物繪制了血清CEA及HE4診斷肺癌的ROC曲線，其研究顯示，血清HE4診斷肺癌具有較高的敏感度和特異度。因此，血清中HE4濃度的升高對于診斷肺癌具有一定臨床應(yīng)用價值。

[1]Galgano MT,Hampton GM,Frierson HJ.Comprehensive analysis of HE4 expression in normal and malignant human tissues[J].Mod Pathol,2006,19(6):847-853.

[2]Molina R,Escudero JM,Auge JM,et al.HE4 a novel tumour mark?er for ovarian cancer:comparison with CA 125 and ROMA algo?rithm in patients with gynaecological diseases[J].Tumour Biol,2011,32(6):1087-1095.

[3]Li J,Dowdy S,Tipton T,et al.HE4 as a biomarker for ovarian and endometrial cancer management[J].Expert Rev Mol Diagn,2009,9(6):555-566.

[4]Tokuishi K,Yamashita S,Ohbo K,et al.Splice variant HE4-V3 ex?pression is associated with favorable prognosis in pulmonary adeno?carcinoma[J].Tumour Biol,2012,33(1):103-109.

[5]Kirchhoff C,Habben I,Ivell R,et al.A major human epididymisspecific cDNA encodes a protein with sequence homology to extra?cellular proteinase inhibitors[J].Biol Reprod,1991,45(2):350-357.

[6]Iwabuchi H,Sakamoto M,Sakunaga H,et al.Genetic analysis of be?nign,low-grade,and high-grade ovarian tumors[J].Cancer Res,1995,55(24):6172-6180.

[7]Bouchard D,Morisset D,Bourbonnais Y,et al.Proteins with wheyacidic-protein motifs and cancer[J].Lancet Oncol,2006,7(2):167-174.

[8]Bingle L,Cross SS,High AS,et al.WFDC2(HE4):a potential role in the innate immunity of the oral cavity and respiratory tract and the development of adenocarcinomas of the lung[J].Respir Res,2006,7:61.

[9]Yamashita S,Tokuishi K,Moroga T,et al.Serum level of HE4 is closely associated with pulmonary adenocarcinoma progression[J].Tumour Biol,2012,33(6):2365-2370.

[10]Iwahori K,Suzuki H,Kishi Y,et al.Serum HE4 as a diagnostic and prognostic marker for lung cancer[J].Tumour Biol,2012,33(4):1141-1149.

[11]Yamashita S,Tokuishi K,Hashimoto T,et al.Prognostic signifi?cance of HE4 expression in pulmonary adenocarcinoma[J].Tumour Biol,2011,32(2):265-271.