曾 敏 吳智勇 鄭 茵 何揚(yáng)利 費(fèi) 毅 劉肖君

心肌缺血再灌注損傷嚴(yán)重影響冠心病患者的預(yù)后。介導(dǎo)再灌注損傷的病理生理機(jī)制有多種，如氧自由基、中性粒細(xì)胞聚集、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、細(xì)胞調(diào)亡等，其中促炎因子大量釋放、激發(fā)炎癥反應(yīng)是非常重要的因素。內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)缺血缺氧十分敏感，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）為建系細(xì)胞，具有操作方便、易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是心血管領(lǐng)域常選用的體外研究細(xì)胞。本研究通過(guò)模擬缺血再灌注培養(yǎng)HUVECs，觀察采用小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）沉默p65對(duì)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和細(xì)胞間黏附分子-1（intercellularadhesion mole?cule-1，ICAM-1）水平的影響，探討缺血再灌注損傷可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 HUVECs購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心（ATCC），于添加內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)物、5%胎牛血清和青/鏈霉素的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。siRNA購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司（sc-29410）。Lipofectamine RNAiMAX、Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；iScriptTMcDNA合成試劑盒（BioRad公司）；TNF-α、ICAM-1 ELISA試劑盒（美國(guó)Ramp;D Systems公司）；SYBR Pre?mix Ex Taq（TaKaRa公司）；吡咯烷二硫代甲酸銨鹽（PDTC）試劑（Sigma公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HUVECs復(fù)蘇后轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶，加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2條件下孵箱內(nèi)培養(yǎng)，5～7 d傳代1次，采用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期HUVECs備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)設(shè)4組：（1）將細(xì)胞置于正常培養(yǎng)液培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA（正常+siRNA陰性轉(zhuǎn)染組）。（2）細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA 24 h后，采用模擬缺血培養(yǎng)液培養(yǎng)（模擬缺血再灌注+siRNA陰性轉(zhuǎn)染組）。（3）細(xì)胞置于正常培養(yǎng)液培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)染p65 siRNA（正常+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組）。（4）細(xì)胞轉(zhuǎn)染p65 siRNA 24 h后，采用模擬缺血培養(yǎng)液培養(yǎng)（模擬缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組）。

1.4 HUVECs轉(zhuǎn)染p65 siRNA 將HUVECs接種于6孔板中，每孔2.0×105個(gè)細(xì)胞，使其在轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度為30%～50%時(shí)融合。于300 μL的無(wú)血清、無(wú)抗生素opti-MEM中稀釋3.6 μL p65 siRNA，混勻。于300 μL的無(wú)血清、無(wú)抗生素opti-MEM中稀釋6 μL轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX（終濃度為20 nmol/L），混勻。再將二者混勻，常溫下孵育15 min，轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)。

1.5 HUVECs模擬缺血再灌注培養(yǎng) 按文獻(xiàn)[1]體外模擬缺血再灌注培養(yǎng)方法，通過(guò)將HUVECs培養(yǎng)在包含118 mmol/L氯化鈉、24 mmol/L碳酸氫鈉、1.0 mmol/L磷酸鈉、2.5 mmol/L氯化鈣、1.2 mmol/L氯化鎂、20 mmol/L乳酸鈉、16 mmol/L氯化鉀、10 mmol/L 2-脫氧葡萄糖（pH調(diào)至6.2）的“缺血液”中30 min，然后換為再灌注液即正常培養(yǎng)基進(jìn)行“再灌注”4 h而實(shí)現(xiàn)。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）測(cè)定TNF-α和ICAM-1 mRNA表達(dá)水平 用Trizol試劑盒抽提細(xì)胞總RNA。定量逆轉(zhuǎn)錄PCR使用iScriptTMcDNA合成試劑盒。18S rRNA作為內(nèi)對(duì)照。實(shí)時(shí)定量采用SYBR Premix Ex Taq和iQ5實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)（BioRad）。引物均由北京三博遠(yuǎn)志公司合成。TNF-α上游引物：5′-CCTGTGAGGAGGAC?GAACAT-3′，下游引物：5′-AGGCCCCAGTTTGAATTCTT-3′,產(chǎn)物片段大小240 bp；ICAM-1上游引物：5′-CAGAGGTT?GAACCCCACAGT-3′，下 游 引 物 ：5′-CCTCTGGCTTCGT?CAGAATC-3′,產(chǎn)物片段大小196 bp；18S rRNA上游引物：5′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3′，下游引物：5′-GCTG?GAATTACCGCGGCT-3′，產(chǎn)物片段大小214 bp。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):mRNA 樣品1 μg，iScript逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，5x iScript反應(yīng)混合物4 μL，加無(wú) RNase 的雙蒸水至20 μL，輕輕振蕩混勻，25℃溫育5 min，42℃溫?zé)?0 min，85℃加熱5 min。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)：cDNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，上下游引物各0.4 μL，SYBR預(yù)混劑10 μL（寶生物DRR041A），DEPC水（Sigma公司）7.2 μL。反應(yīng)條件：第一步95℃30 s，第二步95℃5 s后62℃30 s，此步運(yùn)行40個(gè)循環(huán)，第三步55℃15 s，此步運(yùn)行81個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本3孔，取3批實(shí)驗(yàn)平均值。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定TNF-α、ICAM-1蛋白表達(dá)水平 收集各種實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)HUVECs的上清液，以1 000 r/min離心5 min后再取上清，于-80℃低溫凍存。采用TNF-α、ICAM-1檢測(cè)試劑盒，應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中TNF-α、ICAM-1水平，與其他相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TNF-α、ICAM-1呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度（OD）值，根據(jù)OD值通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到各組樣品濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較行單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組TNF-α mRNA、ICAM-1 mRNA表達(dá)水平比較 見表1。正常+siRNA陰性轉(zhuǎn)染組、正常+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組和模擬缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組的TNF-α mRNA、ICAM-1 mRNA表達(dá)水平均低于模擬缺血再灌注+siRNA陰性轉(zhuǎn)染組（均P＜0.05）；TNF-α mRNA表達(dá)水平在正常+siRNA陰性轉(zhuǎn)染組、正常+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組和模擬缺血再灌注+p65 siR?NA轉(zhuǎn)染組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常+siRNA陰性轉(zhuǎn)染組和正常+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組ICAM-1 mRNA表達(dá)水平低于模擬缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）。

Table 1 Comparison of expression levels of TNF-α and ICAM-1 mRNA between four groups表1 各組TNF-α mRNA、ICAM-1 mRNA表達(dá)水平比較 （n=6，μg/L，x±s）

2.2 各組上清液TNF-α、ICAM-1的蛋白表達(dá)水平比較 正常+siRNA陰性轉(zhuǎn)染組、正常+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組和模擬缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組TNF-α、ICAM-1的蛋白表達(dá)水平均低于模擬缺血再灌注+siRNA陰性轉(zhuǎn)染組，正常+siRNA陰性轉(zhuǎn)染組TNF-α、ICAM-1的蛋白表達(dá)水平均高于模擬缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組（均P＜0.05），見表2。

Table 2 Comparison of protein levels of TNF-α and ICAM-1 supernatants between four groups表2 各組上清液TNF-α、ICAM-1蛋白表達(dá)水平比較 （n=6，μg/L，x±s）

3 討論

炎癥反應(yīng)是缺血再灌注損傷的基本特征，此過(guò)程中有大量促炎因子、黏附分子的介導(dǎo)和參與[2-3]。其中，TNF-α在缺血再灌注早期可激活細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)次級(jí)炎癥因子生成，造成組織細(xì)胞再灌注損傷。ICAM-1是循環(huán)白細(xì)胞聚集浸潤(rùn)引起組織損傷和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵[4]。大量研究表明，多種組織的缺血再灌注損傷均有ICAM-1參與，內(nèi)皮細(xì)胞表面的ICAM-1通過(guò)與中性粒細(xì)胞表面的CD11/CDl8分子相互作用，促使中性粒細(xì)胞牢固地黏附于內(nèi)皮細(xì)胞表面，進(jìn)而游出血管，釋放毒性物質(zhì)，發(fā)揮其損傷作用[5-6]。本研究結(jié)果顯示，體外模擬缺血再灌注培養(yǎng)能刺激TNF-α和ICAM-1在HUVECs的表達(dá)，提示它們參與了體外培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)缺血再灌注刺激的炎癥反應(yīng)，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。

核因子-κB是一種能與多種基因啟動(dòng)子部位中κB位點(diǎn)特異性結(jié)合并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。最普遍存在的核因子-κB形式是由p65和p50兩個(gè)亞基形成的二聚體。其中p50亞基主要起核定位的作用，p65亞基具有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，能激活蛋白表達(dá)[7]。課題組前期研究顯示，核因子-κB通過(guò)自噬介導(dǎo)了家兔心肌缺血再灌注損傷[8]。核因子-κB下游還有許多重要的靶基因，如TNF-α。核因子-κB可促進(jìn)TNF-α的轉(zhuǎn)錄，增高的TNF-α反過(guò)來(lái)又可進(jìn)一步促進(jìn)核因子-κB激活，形成瀑布效應(yīng)，造成惡性循環(huán)[9]。Gu等[10]在小鼠腦缺血再灌注模型上發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B能通過(guò)抑制核因子-κB而起到減少TNF-α分泌，最終改善再灌注損傷的作用。研究顯示腺苷對(duì)心肌缺血再灌注損傷的后適應(yīng)保護(hù)機(jī)制也是通過(guò)抑制TNF-α和核因子-κB實(shí)現(xiàn)的[11]。本研究通過(guò)特異性siRNA的方法沉默p65，能顯著抑制模擬缺血再灌注所誘導(dǎo)的TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)水平，提示核因子-κB參與了對(duì)TNF-α的mRNA和蛋白水平的調(diào)控機(jī)制。ICAM-1也是核因子-κB重要靶基因之一，核因子-κB被激活后即進(jìn)入核內(nèi)啟動(dòng)ICAM-1的mRNA轉(zhuǎn)錄，使ICAM-1表達(dá)增加、活性增強(qiáng)，促進(jìn)白細(xì)胞在血管內(nèi)皮表面的聚集、黏附和遷移，引起組織細(xì)胞損傷。有研究報(bào)道對(duì)腸缺血再灌注大鼠模型使用化學(xué)抑制劑抑制核因子-κB，可減少ICAM-1的表達(dá)和白細(xì)胞的浸潤(rùn)，最終減少再灌注肺損傷[12]。Ma?samune等[6]發(fā)現(xiàn)通過(guò)白細(xì)胞介素（IL）-1β和TNF-α在體外激活大鼠胰腺衛(wèi)星細(xì)胞的核因子-κB，能使其ICAM-1表達(dá)明顯增加，而用核因子-κB活性的特異性抑制劑能有效阻斷ICAM-1的表達(dá)，表明ICAM-1的表達(dá)受到核因子-κB活性的調(diào)控。本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將預(yù)驗(yàn)證的siRNA轉(zhuǎn)染HUVECs成功沉默p65基因，結(jié)果顯示模擬缺血再灌注誘導(dǎo)的核因子-κB和ICAM-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著下降，證實(shí)核因子-κB在缺血再灌注過(guò)程中對(duì)ICAM-1的調(diào)控作用。在對(duì)HUVECs同時(shí)進(jìn)行模擬缺血再灌注培養(yǎng)和p65 siRNA轉(zhuǎn)染的情況下，ICAM-1 mRNA表達(dá)水平還是較正常培養(yǎng)時(shí)轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA的情況表達(dá)高，說(shuō)明缺血再灌注對(duì)ICAM-1 mRNA水平的促進(jìn)途徑可能除p65外還有其他細(xì)胞信號(hào)通路參與。在模擬缺血再灌注情況下，通過(guò)siRNA沉默p65，ICAM-1和TNF-α蛋白水平較正常培養(yǎng)時(shí)轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA的情況表達(dá)低，提示核因子-κB作為轉(zhuǎn)錄因子對(duì)ICAM-1和TNF-α在缺血再灌注情況下的蛋白表達(dá)調(diào)控具有十分重要的意義。采用傳統(tǒng)過(guò)表達(dá)核因子-κB或使用其抑制劑的研究方法，可能會(huì)產(chǎn)生一些非特異性的偽差而影響對(duì)結(jié)果的判斷。與文獻(xiàn)不同的是，本研究采用siRNA即通過(guò)21～23 nt的短雙鏈RNA干擾的方法，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞組織內(nèi)引起高度序列特異性的基因封閉作用，因而研究結(jié)果更為可信。

[1]Venkatachalam K,Prabhu SD,Reddy VS,et al.Neutralization of in?terleukin-18 ameliorates ischemia/reperfusion-induced myocardial injury[J].J Biol Chem,2009,284(12):7853-7865.

[2]Li J,Zhang H,Zhang C.Role of inflammation in the regulation of coronary blood flow in ischemia and reperfusion:mechanisms and therapeutic implications[J].J Mol Cell Cardiol,2012,52(4):865-872.

[3]Markowski P,Boehm O,Goelz L,et al.Pre-conditioning with syn?thetic CpG-oligonucleotides attenuates myocardial ischemia/reper?fusion injury via IL-10 up-regulation[J].Basic Res Cardiol,2013,108(5):376.

[4]Liu G,Place AT,Chen Z,et al.ICAM-1-activated Src and eNOS signaling increase endothelial cell surface PECAM-1 adhesivity and neutrophil transmigration[J].Blood,2012,120(9):1942-1952.

[5]Zhang ZG,Sun X,Zhang QZ,et al.Neuroprotective effects of ultralow-molecular-weight heparin on cerebral ischemia/reperfusion in?jury in rats:involvement of apoptosis,inflammatory reaction and en?ergy metabolism[J].Int J Mol Sci,2013,14(1):1932-1939.

[6]Masamune A,Sakai Y,Kikuta K,et al.Activated rat pancreatic stel?late cells express intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)in vi?tro[J].Pancreas,2002,25(1):78-85.

[7]Sun SC.The noncanonical NF-kappaB pathway[J].Immunol Rev,2012,246(1):125-140.

[8]Zeng M,Wei X,Wu Z,et al.NF-kappaB-mediated induction of au?tophagy in cardiac ischemia/reperfusion injury[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,436(2):180-185.

[9]Chen ZJ.Ubiquitination in signaling to and activation of IKK[J].Im?munol Rev,2012,246(1):95-106.

[10]Gu JH,Ge JB,Li M,et al.Inhibition of NF-kappaB activation is as?sociated with anti-inflammatory and anti-apoptotic effects of Ginkgolide B in a mouse model of cerebral ischemia/reperfusion in?jury[J].Eur J Pharm Sci,2012,47(4):652-660.

[11]Ke JJ,Yu FX,Rao Y,et al.Adenosine postconditioning protects against myocardial ischemia-reperfusion injury though modulate production of TNF-alpha and prevents activation of transcription factor NF-kappaB[J].Mol Biol Rep,2011,38(1):531-538.

[12]Tian XF,Yao JH,Li YH,et al.Effect of nuclear factor kappa B on intercellular adhesion molecule-1 expression and neutrophil infil?tration in lung injury induced by intestinal ischemia/reperfusion in rats[J].World J Gastroenterol,2006,12(3):388-392.